Ingénierie génétique d'organoïdes à l'aide de nanoblades et étude du rôle d'UBTD1 comme modulateur de la force d'adhésion cellulaire dans les organoïdes de prostate

Genetic engineering of organoids using nanoblades and probing the role of UBTD1 as a modulator of cell adhesion strength in prostate organoids

• Auteur / Autrice : Victor Tiroille
• Direction : Frédéric Bost
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 17/12/2021
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre Méditerranéen de Médecine Moléculaire (Nice)
• Jury : Président / Présidente : Els Verhoeyen
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Els Verhoeyen, Vincent Goffin, Rik Gijsbers, Kai Kretzschmar
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Vincent Goffin, Rik Gijsbers

Mots clés

Mots clés contrôlés

CRISPR (génétique)

CRISPR-Cas9

Prostate

Jonctions cellulaires

Organoïdes

Mots clés libres

Organoïde

CRISPR

Jonctions cellulaires

UBTD1

Nanoblade

Prostate

Organoid

CRISPR

Cell junction

UBTD1

Nanoblade

Prostate

Résumé

Au cours de ma thèse, j'ai travaillé sur le modèle d'organoïde 3D en suivant deux objectifs principaux : i) développer des outils génétiques pour modifier le génome des organoïdes et ii) déchiffrer le rôle de la ubiquitin domain-containing protein 1 (UBTD1) dans le développement des organoïdes de la prostate.L'ingénierie du génome est devenue ces dernières années plus accessible grâce aux endonucléases programmables par ARN telles que le système CRISPR-Cas9. Cependant, l'utilisation de cette technologie d'édition dans des organes synthétiques appelés "organoïdes" reste très inefficace. Ceci est principalement dû aux méthodes de livraison utilisées pour la machinerie CRISPR-Cas9, qui sont principalement réalisées par électroporation de RNP contenant le complexe CAS9-gRNA, une procédure toxique pour les organoïdes. Nous décrivons ici l'utilisation de la technologie "Nanoblade" pour réaliser l'édition du génome dans les organoïdes. Les nanoblades ont dépassé de loin les niveaux de knock-out (KO) obtenus avec d'autres techniques utilisées jusqu'à présent pour la livraison de la machinerie d'édition de gènes. Nous avons atteint jusqu'à 80 % de knockout génétique dans les organoïdes après traitement avec les nanoblades. Nous avons atteint un niveau élevé de KO médié par les nanoblades pour le gène codant le récepteur des androgènes (AR) et le gène du cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) avec des nanoblades contenant un seul ARNg ou un double ARNg. Plus important encore, contrairement à d'autres méthodes d'édition de gènes, ce résultat a été obtenu sans toxicité pour les organoïdes. En outre, il ne faut que quatre semaines pour obtenir des lignées stables KO pour un gène dans les organoïdes et aucun INDELS indésirable évident dans un site hors cible du génome n'a été détecté. En conclusion, les nanoblades simplifient et permettent une édition rapide du génome dans les organoïdes avec peu ou pas d'effets secondaires.La morphogenèse et le remodelage des tissus sont des processus finement régulés, régis par les adhésions entre cellules. Cependant, le contrôle spatial et temporel des molécules d'adhésion reste partiellement inexploré. Nous avons étudié ici le rôle d'UBTD1 comme modulateur de la force des adhérences dans l'épithélium de la prostate. Nous avons montré que la régulation négative d'UBTD1 perturbe l'auto-organisation des cellules en trois dimensions. Inversement, nous avons démontré que la surexpression d'UBTD1 induit des monocouches épithéliales plus régulières et augmente la tension de la surface cellulaire. Les analyses transcriptomiques ont révélé un profil d'expression génique des protéines impliquées dans les jonctions cellulaires affectées par la modulation d'UBTD1. En utilisant le modèle d'organoïde de prostate, nous avons montré que l'expression d'UBTD1 dans les cellules luminales perturbait la formation de lumen dans les organoïdes de prostate de souris. Enfin, en utilisant une approche de co- immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons montré que UBTD1 interagit avec des partenaires impliqués dans les jonctions cellule-cellule et que ces interactants voient leur expression modulée par la dérégulation de UBTD1. Nos résultats montrent qu'une protéine impliquée dans les processus de dégradation des protéines régule la force des jonctions d'adhérence.

During my thesis, I worked on the 3D organoid model following two main objectives: i) developing genetic tools to modify the genome of organoids and ii) deciphering the role of ubiquitin domain-containing protein 1 (UBTD1) in the development of prostate organoids . Genome engineering has become in the last few years more accessible thanks to the RNA programmable endonucleases such as the CRISPR-Cas9 system. However, using this editing technology in synthetic organs called ‘organoids’ is still very inefficient. This is mainly due to the delivery methods used for the CRISPR-Cas9 machinery, which are predominantly performed by electroporation of RNPs containing the CAS9-gRNA complex, a procedure toxic for the organoids. Here we describe the use of the ‘Nanoblade’ technology to accomplish genome editing in organoids. Nanoblades outperformed by far knockout (KO) levels achieved with other techniques used to date for delivery of the gene editing machinery. We reached up to 80% of gene knockout in organoids after treatment with nanoblades. We achieved high-level nanoblade-mediated KO for the androgen receptor (AR) encoding gene and the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene with single gRNA or dual gRNA containing nanoblades. Most importantly, in contrast to other gene editing methods, this was obtained without toxicity for the organoids. Moreover, it requires only four weeks to obtain stable lines KO for a gene in organoids and no obvious unwanted INDELS in off-target site in the genome were detected. In conclusion, nanoblades simplify and allow rapid genome editing in organoids with little to no side-effects.Morphogenesis and tissue remodeling are finely regulated processes governed by cell-cell adhesions. However, the spatial and temporal control of adhesion molecules remains partially unexplored. Here we studied the role of UBTD1 as a modulator of the strength of adherens in the prostate epithelium. We showed that down-regulation of UBTD1 disrupted the self- organization of cells in three dimensions. Conversely, we demonstrated that overexpression of UBTD1 induced more regular epithelial monolayers and increased cell surface tension. Transcriptomic analyses revealed a gene expression profile of proteins involved in cell junctions affected by UBTD1 modulation. Using the prostate organoid model, we showed that UBTD1 expression in luminal cells disrupted cyst formation in mouse prostate organoids. Finally using a co-immunoprecipitation approach coupled to mass spectrometry, we showed that UBTD1 interacts with partners involved in cell-cell junctions and that these interactants have their expression modulated by UBTD1 deregulation. Our results show that a protein involved in protein degradation processes regulates the strength of adherens junctions.