Étude du rôle d’EZH2 dans l’hépatoblastome et analyse de l’organisation tridimensionnelle de cette tumeur pédiatrique par microscopie électronique

Study of the role of EZH2 in hepatoblastoma and analysis of the tridimensional organization of this pediatric tumor by electron microscopy

• Auteur / Autrice : Fatma Zohra Khoubai
• Direction : Christophe Grosset
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Cellulaire et Physiopathologie
• Date : Soutenance le 15/12/2021
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biothérapie des maladies génétiques inflammatoires et cancers (Bordeaux ; 2011-2021)
• Jury : Président / Présidente : Abdel-Majid Khatib
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Xuefen Le Bourhis, Christel Genoud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cisplatine

Foie -- Transplantation

Chimiothérapie

Enfants -- Maladies

Cellules cancéreuses

Mots clés libres

Cancer

Foie

Hépatoblastome

Ezh2

DUSPs

Microscopie électronique 3D

Cancer

Liver

Hepatoblastoma

Ezh2

DUSPs

3D electron microscopy

Résumé

L’hépatoblastome (HB) est un cancer rare qui touche principalement les enfants âgés de 6 mois à 3 ans et dont la survie globale à 5 ans est d’environ 80%. Le traitement de référence de ce cancer associe une chimiothérapie à base de Cisplatine et une résection chirurgicale de la tumeur ou une transplantation hépatique. Dans le cas des tumeurs de haut risque (métastatique, agressive, touchant la globalité du foie, sujet âgé), cette chimiothérapie est utilisée à fortes doses avec des conséquences néfastes pour la qualité de vie des enfants après la maladie et elle ne garantit pas l’absence de récidive.En 2018, notre équipe a effectué une étude transcriptomique sur 25 échantillons d’HB et de foies normaux adjacents par RNA-seq (PMID : 29152775). L'analyse a mis en évidence l'existence de 3 groupes indépendants d'HB dénommés C1, C2A et C2B. Au niveau moléculaire, le groupe hautement prolifératif et de mauvais pronostic C2A est caractérisé par une augmentation spécifique de plusieurs composants du complexe répressif polycomb-2 (PRC2), et notamment de la méthyl-transférase EZH2 et de ses cofacteurs SUZ12 et EED.Grâce à l'utilisation complémentaire d'approches cellulaires 2D et 3D et d'un modèle in vivo chez l'embryon de poulet, nous avons confirmé le rôle oncogénique d'EZH2 dans l'HB C2A. Nous avons ensuite démontré le lien entre ce gène et la résistance des cellules tumorales au Cisplatine. La combinaison du cisplatine et d’un inhibiteur spécifique d'EZH2 a un effet additif pour bloquer la prolifération et la survie des cellules HB, montrant qu’EZH2 est une cible thérapeutique dans ce cancer. Par protéomique, nous avons identifié de nouveaux gènes régulés par EZH2 dans les cellules d’HB. Parmi ces gènes, nous nous sommes intéressés aux phosphatases à double spécificité (Dual-specificity Phosphatases) DUSP5 et DUSP9, qui sont connues pour inhiber la voie MAPK/ERK en déphosphorylant les kinases ERK1/2. L'expression de ces deux DUSPs est fortement corrélée à l'expression d'EZH2 dans les échantillons d’HB. Nos données montrent également que la dérégulation d'EZH2 et des DUSPs DUSP5 et DUSP9 dans l’HB est associée à plusieurs paramètres de mauvais pronostic et notamment la baisse de survie globale des patients, la récidive tumorale et la présence de métastases. Le rôle de ces DUSPs dans l'HB C2A est actuellement à l'étude et ces travaux devraient conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des patients présentant un HB de haut risque.Parallèlement à ce premier projet, nous avons analysé l'organisation spatiale de tissus de xénogreffes dérivées de patients HB (patient-derived xenograft, HB-PDX) par microscopie électronique à balayage de blocs en série (SFB-SEM). A l’aide de l’imagerie tridimensionnelle (3D), d’approches de segmentation manuelle et semi-automatique basées sur l'apprentissage et l’intelligence artificielle, d’approches mathématiques et infographiques, nous avons reconstruit sous format digital un fragment de tissu d'HB comprenant un capillaire sanguin, une structure proche d’un canalicule biliaire, des dizaines de cellules tumorales ainsi que leurs principaux organelles (cytoplasme, noyau, mitochondries). Les résultats obtenus permettent d’avoir une vue détaillée de l’organisation architecturale du tissu d’HB. Nous avons notamment découvert que la taille des cellules tumorales est corrélée à celle de leur noyau, de leur cytoplasme et de leur réseau mitochondrial. Nous avons également découvert que le capillaire sanguin influence l'alignement anatomique et la taille des cellules tumorales au sein du tissu et qu’un groupe de cellules d’HB polarise en direction d’une structure qui ressemble à un canalicule biliaire. Cette étude pilote par imagerie 3D a permis d'identifier des paramètres bioarchitecturaux qui définissent l'organisation interne et spatiale des tumeurs, ouvrant ainsi la voie à des études originales dans un domaine émergent que nous avons appelé « onconanotomie ».

Hepatoblastoma (HB) is a rare cancer that mainly affects children aged of 6 months to 3 years and has a 5-year overall survival of approximately 80%. The standard treatment for this cancer comprises Cisplatin-based chemotherapy and surgical resection of the tumor or liver transplantation. In the case of a high-risk hepatoblastoma (metastatic, aggressive, tumor globally affecting the liver, aged patients), this chemotherapy uses high doses of drugs with harmful consequences for children’s quality of life after the disease and does not guarantee the absence of recurrence.In 2018, our team performed a transcriptomic study on 25 HB and normal matched liver by RNA-seq (PMID: 29152775). The analysis revealed the existence of 3 independent groups of HB called C1, C2A and C2B. At the molecular level, the highly proliferative and poor prognosis group C2A is characterized by a specific increase in several components of the repressive polycomb-2 (PRC2) complex including the methyl transferase EZH2 and its cofactors SUZ12 and EED.Through the complementary use of 2D and 3D cellular approaches and an in vivo model in chick embryo, we demonstrated the oncogenic role of EZH2 in HB C2A and the link between this gene and the resistance of HB cells to Cisplatin. The combination of cisplatin and a specific EZH2 inhibitor had an additive effect to impede the proliferation and the survival of HB cells suggesting that EZH2 is a relevant therapeutic target in proliferative HB.By proteomics, we identified new genes regulated by EZH2 in HB cells among which the Dual-specificity Phosphatases, DUSP5 and DUSP9. These two phosphatases have been described to inhibit the MAPK/ERK pathway by dephosphorylating the ERK1/2 kinases. Expression of strongly correlated with the expression of EZH2 in HB samples. Our data also showed that the deregulation of EZH2, DUSP5 and DUSP9 in HB is associated with several poor prognosis parameters including a decreased overall survival in patients, tumor recurrence and metastasis. The role of DUSP5 and DUSP9 in HB C2A is currently under study and this work should lead to the identification of new therapeutic targets in the treatment of children with high-risk HB.In parallel to this first project, we analyzed the spatial organization of tumor xenograft samples derived from HB patients (patient-derived xenograft, HB-PDX) by serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM). Using three-dimensional (3D) imaging, manual and semi-automatic segmentation approaches based on machine learning and artificial intelligence, mathematical and infographic approaches, we digitally reconstructed a whole HB sample containing a blood capillary, a structure close to a bile canaliculus, tumor cells and their main organelles (cytoplasm, nucleus, mitochondria). The results obtained provide a detailed view of the spatial organization of HB tissue. In particular, we have found that the size of tumor cells is correlated with the size of their nucleus, cytoplasm and mitochondrial network. We also found that the blood capillary influences the anatomical alignment and size of tumor cells within the tissue. Moreover, we reported that a group of HB cells polarized towards a bile canaliculus-like structure. In conclusion, this pilot study by 3D electron microscopy allowed the identification of bioarchitectural parameters which constitute the internal and spatial organization of tumor tissues, thus opening the way to new investigations in an emerging field that we have called “onconanotomy”.