Sécurisation de la thérapie génique par CRISPR-Cas9 dans les pathologies du globule rouge

Safety concerns regarding CRISPR-Cas9 gene therapy in red blood cells diseases

• Auteur / Autrice : Julian Boutin
• Direction : François Moreau-Gaudry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 23/11/2021
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biothérapie des maladies génétiques inflammatoires et cancers (Bordeaux ; 2011-2021)
• Jury : Président / Présidente : Benoît Arveiler
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François Moreau-Gaudry, Benoît Arveiler, Laurent Gouya, Patricia Martinez, Damien Sanlaville, Hervé Puy
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurent Gouya, Patricia Martinez

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hémoglobinopathie

Porphyrie érythropoïétique congénitale

Cellules souches hématopoïétiques

Thérapie génique

Mots clés libres

Crispr-Cas9

Thérapie génique

Correction génique

Cellules souches hématopoïétiques

Porphyrie eyrthropoiétique

Hémoglobinopathies

Crispr-Cas9

Gene therapy

Gene editing

Hematopoietic stem cells

Erythropoietic porphyria

Hemoglobinopathies

Résumé

L’objectif de ce travail a été d’étudier la génotoxicité de la thérapie génique par CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats)-Cas9 (CRISPR associated protein) et de proposer une sécurisation dans des modèles de maladies héréditaires du GR, la porphyrie érythropoïétique congénitale et les béta-hémoglobinopathies. Les bêta-hémoglobinopathies comprennent la drépanocytose et la bêta-thalassémie et sont les maladies monogéniques les plus fréquentes dans le monde contrairement à la porphyrie érythropoïétique congénitale qui est très rare. La thérapie génique pourrait être une approche thérapeutique prometteuse pour ces maladies graves. L'édition du génome par CRISPR-Cas9 est revendiquée comme une alternative à la thérapie génique additive. Nous avons utilisé les coupures doubles brins d’ADN induites par la nucléase Cas9 au locus UROS pour éditer la porphyrie érythropoïétique congénitale et au locus bêta-globine pour éditer les bêta-hémoglobinopathies. Nous avons démontré qu'après une seule coupures double brin d’ADN par CRISPR, les insertions-délétions au site de coupure du locus UROS sur le chromosome 10, pouvaient être concomitantes de grandes délétions chromosomiques inattendues dans des lignées cellulaires mais aussi dans des cellules primaires déficientes pour TP53. Nous avons confirmé ce résultat au locus bêta-globine sur le chromosome 11 dans une lignée cellulaire. De plus, dans les cellules souches hématopoïétiques, nous avons décrit un autre type de génotoxicité au locus bêta-globine : des pertes d'hétérozygotie copies neutres conduisant à une disomie uniparentale partielle 11p15.5. Ces nouvelles données sont cruciales car les thérapies géniques basées sur CRISPR-Cas9 sont en cours pour les bêta-hémoglobinopathies chez les patients. Au total, ces effets secondaires sont à prendre en compte pour la modélisation de maladies et pour la thérapie génique. Nos données mettent en évidence la nécessité de contrôler et d'améliorer la sécurité de CRISPR-Cas9 et nous avons proposé une alternative à CRISPR-Cas9-nucléase grâce à l'utilisation de la nickase dans une lignée cellulaire.

The objective of this work was to study the genotoxicity of gene therapy by CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) -Cas9 (CRISPR Associated protein) and to propose safety in models of inherited red blood cell diseases, congenital erythropoietic porphyria and beta hemoglobinopathies. Beta-hemoglobinopathies include sickle cell disease and beta-thalassemia and are the most common monogenic diseases in the world unlike congenital erythropoietic porphyria, which is very rare. Gene therapy could be a promising therapeutic approach for these severe diseases. CRISPR-Cas9 mediated genome editing is claimed as an alternative to additive gene therapy. We used Cas9 nuclease-induced double-strand break DNA at the UROS locus to edit congenital erythropoietic porphyria and at the beta-globin locus to edit beta-hemoglobinopathies. We demonstrated, that after a single CRISPR-mediated double-strand break DNA, the on-target insertion-deletions at the UROS locus on the chromosome 10 could be concomitant to unexpected chromosomal large deletions in cell lines but also in primary cells deficient for TP53. We confirmed this concern at the beta-globin locus on chromosome 11 in cell line. Moreover, in hematopoietic stem cells, we described another kind of genotoxicity at the beta-globin locus: copy-neutral losses of heterozygosity leading to 11p15.5 partial uniparental disomy. These new data are crucial because CRISPR-Cas9-based gene therapies are just ongoing for beta-hemoglobinopathies in patients. Altogether, these side effects must be taken into account for disease modeling and for gene therapy. Our data highlight the need to control and improve CRISPR-Cas9 safety and we have proposed an alternative to CRISPR-Cas9-nuclease through the use of nickase in cell line.