TrypanoFluidics : Compartmentalization, cultivation and analysis of Trypanosoma brucei by droplet-based micro uidics

TrypanoFluidique : compartimentation, culture et analyse de la microfluidique de gouttes de Trypanosoma brucei

• Auteur / Autrice : Simone Oldenburg
• Direction : Jean-Christophe Baret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physico-Chimie de la Matière Condensée
• Date : Soutenance le 12/11/2021
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche Paul Pascal (Pessac ; 1963-....)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Zakri
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Christophe Baret, Cécile Zakri, Tom Robinson, Nicolai Siegel, Axel Hochstetter, Loïc Rivière
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Tom Robinson, Nicolai Siegel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Trypanosomiase africaine

Microfluidique

Trypanosoma brucei

Mots clés libres

Microfluidique en gouttes

Trypanosoma brucei

Analyse de cellules uniques

Sécrétion d’enzymes

Droplet-Based microfluidics

Trypanosoma brucei

Single-Cell analysis

Enzyme secretion

Résumé

Trypanosoma brucei est un parasite protozoaire infectant les mammifères en Afrique subsaharienne et provoquant la maladie connue sous le nom de maladie du sommeil. Les parasites sont transmis entre les hôtes mammifères par les piqûres d’un insecte vecteur. La transmission de l’insecte au mammifère est l’une des nombreuses étapes d’un cycle de vie complexe provoquant de nombreux changements métaboliques et physiologiques. Alors que la majorité d’une population se prépare à réintégrer l’insecte vecteur, une fraction de la population s’adapte en permanence au système immunitaire de l’hôte, montrant un schéma hétérogène au sein de la population. Bien que de nombreuses méthodes analytiques soient continuellement développées pour étudier les cellules individuelles, on sait encore peu de choses sur T. brucei au niveau cellulaire. La microfluidique en gouttes est un outil à haut débit pour l’analyse de cellules uniques qui a émergé au cours des dernières décennies. Nous avons développé ici une méthode analytique pour les mesures quantitatives au niveau de la cellule unique basées sur l’encapsulation et la culture de T. brucei dans des gouttes agissant comme des microcompartiments. Nous avons décrit un système microfluidique pour l’encapsulation et l’analyse de cellules individuelles basées sur des mesures de fluorescence. Nous avons d’abord montré la survie de T. brucei pendant plusieurs heures à plusieurs jours dans des gouttelettes avec une influence à la fois sur la survie et la croissance par la taille des gouttelettes. Nous avons observé divers modèles de croissance au sein d’une population et avons découvert que la culture par gouttes de trypanosomes révélait des variants cellulaires à division élevée avec des densités cellulaires 10 fois plus élevées que les techniques de culture standard. Nous avons en outre combiné l’encapsulation de T.brucei avec un test de détection enzymatique pour étudier la sécrétion de protéase. L’utilisation d’un substrat basé sur la fluorescence a permis la détection de l’activité protéase sécrétée par des cellules individuelles. Enfin, nous avons testé la configuration dans deux applications supplémentaires, toutes deux utilisées sur T. brucei unicellulaire. En conclusion, la microfluidique en gouttes s’est révélée prometteuse en tant qu’outil analytique pour la culture et l’analyse des trypanosomes avec un potentiel supplémentaire pour l’analyse unicellulaire à haut débit.

Trypanosoma brucei are protozoan parasites infecting mammals in Sub-Saharan Africa causing the disease known as Sleeping sickness. The parasites are transmitted between the mammal hosts through bites of an insect vector. The transmission from insect to mammal is one out of many steps in a complex life cycle causing numbers of metabolic and physiological changes. While the majority of a population is preparing to reenter the insect vector, a fraction of the population continuously adapt to the immune system of the host, showing a heterogeneous pattern within the population. Though numerous analytical methods for studying single cells are continuously developed, little is still know of T. bruceion a single-cell level. Droplet-based microfluidicsis a high-throughput tool for single cell analysis emerging within the last decades. We here developed an analytical method for quantitative measurements at the single cell level based on encapsulation and cultivation of T. brucei in microcompartment droplets. We described a microfluidic system for single-cell encapsulation and analysis based on fluorescence measurements. We first showed the survival of T. brucei for several hours to days in droplets with influence on both survival and growth by the droplet size. We unraveled various growth patterns within a population, and found that droplet cultivation of trypanosomes revealed highly dividing cell variants with10-fold higher cell densities compared to standard cultivation techniques. We further combined the encapsulation of T. brucei with an enzymatic detection assay to study protease secretion. Using a fluorescence based substrate allowed detection of protease activity secreted from single cells. Lastly, we tested the setup in two additional applications both used on single-cell T. brucei. Conclusively, droplet-based microfluidics have shown promising as an analytical tool for trypanosome cultivation and analysis with a further potential for high-throughput single-cell analysis.