Quelles stratégies pour soutenir la translation clinique en recherche sur le poumon néonatal? Apports d'approches multidisciplinaires visant à améliorer notre compréhension du développement pulmonaire humain normal (single nuclei RNA seqencing), valider la pertinence clinique d’un vecteur viral de thérapie génique sur du tissu pulmonaire humain (precision cut lung slices), et développer une définition consensuelle et des lignes directrices pour reporter les essais cliniques utilisant les cellules stromales mésenchymateuses.

How to support clinical translation in neonatal lung research? Insights from multidisciplinary approaches to enhance our knowledge on normal human lung development in utero (single-nuclei RNA sequencing), provide proof of concept for gene therapy vir

• Auteur / Autrice : Laurent Renesme
• Direction : Eric Dumas de la Roque, Bernard Thébaud, Christophe Delacourt
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Cellulaire et Physiopathologie
• Date : Soutenance le 08/09/2021
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Physiopathologie Vasculaire Pulmonaire
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche cardio-thoracique de Bordeaux
• Jury : Président / Présidente : Anne-Monique Nuyt
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Eric Dumas de la Roque, Bernard Thébaud, Christophe Delacourt, Anne-Monique Nuyt, Thierry Lacaze-Masmonteil, Pierre-Henri Jarreau, Laurent Storme, Thierry Debillon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne-Monique Nuyt, Thierry Lacaze-Masmonteil, Christophe Delacourt

Mots clés

Mots clés contrôlés

Études cliniques

Biologie -- Recherche

Pneumologie néonatale

Cellules stromales mésenchymateuses

Delphi, Méthode

Mots clés libres

Développement pulmonaire

Single-Nuclei RNA sequencing

Precision cut lung slices

Cellules stromales mésenchymateuses

Méthode Delphi

Recherche translationelle

Lung development

Single-Nuclei RNA sequencing

Precision cut lung slices

Mesenchymal stromal cells

Delphi method

Translational research

Résumé

Dans ce travail, nous rapportons 3 projets visant à améliorer et soutenir la translation clinique en recherche sur le poumon néonatal.Premièrement, nous décrivons l’utilisation du séquençage d'ARN sur noyaux uniques (single nuclei RNA sequencing ou snRNA-seq) pour étudier le développement pulmonaire humain. Le snRNAseq sur 23,251 noyaux cellulaires isolés à partir de neuf fœtus humains (âges gestationnels de 14 à 19 semaines de gestation) a permis de décrire neuf types cellulaires, incluant des populations cellulaires rares telles que les cellules pulmonaires neuroendocrines. Pour chaque type cellulaire, des gènes marqueurs ont été identifiés et utilisés pour confirmer la répartition spatiale cellulaire au sein du tissu par hybridation in situ en fluorescence (FISH). Les analyses d’enrichissement et de trajectoires développementales ont permis de décrire les modifications des voies moléculaires et de signalisation au sein d’un même type cellulaire en fonction de l'âge gestationnel. L’analyse des interactions ligands-récepteurs a mis en évidence les voies de communications entre les différents types cellulaires. Ces résultats offrent une perspective clinique majeure pour générer des hypothèses de recherche pertinentes pour tout projet étudiant le développement pulmonaire normal ou altéré et développer et valider des modèles de substitution pour étudier le développement pulmonaire humain (organoïdes pulmonaires humains).Le second projet décrit l’utilisation de culture organotypique dérivée de tissu pulmonaire humain pour valider l’utilisation potentielle chez l’humain d’un virus adéno-associé (AAV pour adeno-associated virus) comme vecteur de thérapie génique pour traiter le déficit en protéine B du surfactant pulmonaire. Nous avons développé un modèle de “precision cut lung slices” (PCLS) obtenues à partir de poumons fœtaux humains, ces PCLS pouvaient être maintenues en culture et conserver leur activité métabolique et architecture pendant plus de 7 jours. Les PCLS ont ensuite été utilisées pour valider avec succès la transfection du vecteur AAV dans le parenchyme pulmonaire humain. Cette transfection suivait un effet dose-dépendant et ne présentait pas d’effet délétère (évalué par le niveau d’activité métabolique et l’architecture des PCLS). Ces données démontrent l’intérêt des PCLS issues de poumons humains pour évaluer des thérapeutiques, soulignant l’importance de modèles expérimentaux complexes utilisant du tissu humain en recherche translationnelle.Le troisième projet vise à développer une définition consensuelle pour les cellules stromales mésenchymateuses (Mesenchymal Stromal Cells ou MSC) et des lignes directrices pour reporter des essais cliniques utilisant des MSC pour améliorer la rigueur, la reproductibilité, la transparence de la recherche utilisant les MSC afin de garantir une translation sûre de thérapies cellulaires efficaces en clinique. Notre protocole de recherche combine une méthodologie utilisée pour le développement de consensus appelée méthode Delphi en combinaison avec une stratégie de transmission des connaissances. Nous présentons ici notre protocole de recherche détaillé et les résultats d'une synthèse de la littérature (scoping review) menée pour décrire comment les MSC sont définies et caractérisées en recherche préclinique et clinique. L’analyse de notre échantillon d’études originales a mis en évidence une grande variabilité et des incohérences dans la description des MSC, leurs caractéristiques et leurs conditions de culture. De plus, la majorité des essais cliniques rapportaient de façon variable et non exhaustive ces caractéristiques importantes des MSC. Ce projet souligne l'importance du choix de la méthode d'élaboration de consensus et l’aspect fondamental des stratégies de transmission de savoir en recherche translationnelle.

In this thesis, we present 3 different projects that aim to support clinical translation in neonatal lung research.First, we use state-of-the-art approach to study normal human lung development at a single-cell level. We report the cellular composition, cell trajectories and cell-to-cell communication in developing human lungs with single nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) on 23.251 nuclei isolated from nine human fetuses with gestational ages between 14 to 19 weeks of gestation. We describe nine different cell types, including rare cell populations such as pulmonary neuroendocrine cells. For each cell type, marker genes are reported and use for spatial validation using fluorescent RNA in situ hybridization. Enrichment and developmental trajectory analysis provide insight into molecular mechanisms and signaling pathways changes within cell type according to gestational age. Last, ligand-receptor analysis highlights determinants of cell-to-cell communication among the different cell types. These findings will provide a clinically relevant background for research hypotheses generation in projects studying normal or impaired lung development and help to develop and validate surrogate models to study human lung development such as human lung organoids.Second, we use a model of organotypic culture called Precision Cut Lung Slices (PCLS) from human fetal lung tissue to validate the clinical relevance of a viral vector (Adeno-associated virus AAV) for gene therapy for surfactant B deficiency in neonates. We develop a protocol to obtain and culture PCLS from human fetal lung tissues. We reported that these PCLS can be maintained up to 7 days in culture with a preserved metabolic activity and architecture. These PCLS were then successfully used to provide proof of concept that the AAV vector can efficiently transfect human lung parenchyma. PCLS were incubated at day 3 of culture with different titers of AAV (and with different cargos: mouse SPB and human SPB) for 24 hours. On day 7 of culture, we confirmed by bioluminescence and immunofluorescence that AAV can transfect human lung parenchyma with a dose dependent effect. Furthermore, assessment of the PCLS (by metabolic activity and architecture) demonstrated the absence of adverse effects on human lung tissue transfected by AAV vector. Therefore, PCLS from human lung tissue (healthy or diseased) represent a versatile tool to assess pathophysiology or therapeutics in an organotypic culture setting. It aligns with the need for more complex and holistic models and the use of human tissue in translational research.Last, we aim to develop a consensus definition for Mesenchymal Stromal Cell (MSC) and reporting guidelines for clinical trials of MSC therapy to enhance rigour, reproducibility, transparency in the MSC research and ultimately the safe translation of effective cell-based therapies in humans. Our research protocol uses the unique attributes of a consensus-building method called modified Delphi method in combination with an ‘integrated knowledge translation’ approach where key stakeholders and end-users are involved from inception and participate in every step of the study to support dissemination and implementation of the findings. We present here our detailed research protocol, and the results of a scoping review conducted to describe how MSC were defined and characterized in preclinical and clinical research. In this scoping review, we report that previous minimal criteria to define MSC provided by the International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) were poorly implemented with inconstant reporting among in both preclinical and clinical studies. More concerning, the clinical studies showed inconsistent completeness in reporting relevant and important information on MSC characterization and cell manufacturing processes. This project highlights important points for consensus-building strategies and the critical step of knowledge translation in translational research.