Caractérisation de l'organisation et du trafic de paires récepteur/anticorps thérapeutiques par microscopie de localisation de molécules uniques couplée au criblage à haut débit.

par Marine Cabillic

Thèse de doctorat en Bioinformatique

Sous la direction de Jean-Baptiste Sibarita.

Soutenue le 28-01-2021

à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux) , en partenariat avec Institut Interdisciplinaire de Neurosciences (Bordeaux) (laboratoire) .


  • Résumé

    L'immuno-oncologie est un domaine en pleine expansion, à la frontière de la thérapie du cancer. Les immunothérapies du cancer visent à stimuler le système immunitaire de l'organisme pour qu'il cible et attaque la tumeur, grâce à des anticorps thérapeutiques. Ces anticorps se lient spécifiquement aux récepteurs membranaires des cellules T, lymphocytes jouant un rôle central dans la réponse immunitaire, modifiant leur signalisation intracellulaire. Comprendre comment l'organisation spatiale des récepteurs et des protéines de signalisation est régulée, et comment elle détermine l'activation des lymphocytes, est devenu le "Saint Graal" de l'immunologie cellulaire. Dans cette optique, une meilleure compréhension des fonctions des anticorps et du trafic intracellulaire associé, permettrait d’expliciter les différences d’efficacité des candidats thérapeutiques ciblant les récepteurs d'intérêt. La microscopie de super-résolution permet l’accès à l'organisation et la dynamique des récepteurs membranaires avec des résolutions nanométrique. Elle offre la capacité de révéler des informations sur les évènements précoces déclenchés par la liaison d’un anticorps à son récepteur, permettant à terme l’optimisation de leur efficacité fonctionnelle. Associée aux techniques de criblage à haut débit, elle a le potentiel de jouer un rôle prépondérant dans les phases précoces des projets où il est nécessaire de sélectionner les meilleurs anticorps issus de banques pouvant en compter plusieurs centaines.L'objectif de cette thèse CIFRE a été de caractériser fonctionnellement l'organisation et le trafic de paires récepteur/anticorps par l’association de méthodes de microscopie super-résolution par localisation de molécules individuelles (SMLM) et de criblage à haut débit (HCS). Dans ce contexte, nous avons mis au point et utilisé une plateforme permettant de caractériser différents anticorps thérapeutiques ciblant des récepteurs de cellules T, dans le but de recueillir des informations quantitatives sur les candidats thérapeutiques potentiels. Nous avons également optimisé la technique d'imagerie à feuille de lumière simple objectif (soSPIM) dans le but de pouvoir réaliser une cartographie 3D des récepteurs membranaires sur d'une cellule T entière avec une résolution nanométrique. Cette nouvelle approche permet l'imagerie de cellules T dans des conditions plus physiologiques, fournissant des informations complémentaires par rapport aux expériences de criblage à grande échelle. Ces deux techniques nous ont permis d’améliorer notre compréhension du mode d'action des anticorps sur les récepteurs au niveau de la cellule unique. Les expériences à grande échelle réalisées dans le cadre de ce travail ont nécessité plusieurs développements logiciels pour l'automatisation de l'acquisition et l'analyse statistique des Téraoctets de données de molécules individuelles générées.  Ce projet de thèse s'est concentré sur la cible PD-1, un point de contrôle crucial du système immunitaire impliqué dans la modulation de l'activation des lymphocytes. La première partie de la thèse a été principalement consacrée à la mise en place de nouveaux protocoles pour l'imagerie de super-résolution des récepteurs PD-1 sur cellules Jurkat activées. La seconde partie concerne l’étude de l'impact d’anticorps thérapeutiques anti-PD-1 utilisés en routine en clinique, sur l'organisation spatiale et la dynamique des récepteurs PD-1 sur cellules vivantes, à l’échelle nanométrique. Ce travail est la preuve concept de l’utilité de ces outils d’imagerie de pointe pour la caractérisation quantitative d’anticorps monoclonaux thérapeutiques ciblant PD-1 à la membrane des cellules T.

  • Titre traduit

    Characterization of therapeutic antibody/receptor pairs nanoscale organization & trafficking by quantitative single molecule localization microscopy combined with high content screening


  • Résumé

    Immuno-oncology is a young and growing field at the frontier of cancer therapy. Immuno-oncology therapies aim to stimulate the body's immune system to target and attack the tumor through therapeutic antibodies, by binding and modifying the intracellular signaling of T-cells (lymphocytes playing a central role in the immune response) surface receptors. Understanding how the spatial organization of receptors and signaling proteins is regulated and how it determines lymphocyte activation and cell fate decisions has become a ‘holy grail’ for cellular immunology. To achieve this goal, a better comprehension of antibodies functions and subcellular trafficking is requested to explain the differential efficacies of therapeutic candidates targeting receptors of interest. Quantitative super-resolution microscopy provides access to the nanoscale organization of membrane receptors playing a physiological role. It offers a new investigation tool for antibody optimization as well as maximizing their functional efficacy. In combination with high throughput screening techniques, it has the potential to play a crucial role in the early phases of projects in which it is necessary to select the best antibodies from banks that may contain several hundred of them. The goal of this PhD thesis was to functionally characterize receptor/antibodies pairs organization and trafficking by quantitative single-molecule localization microscopy (SMLM) combined with high content screening (HCS). In this context, we have developed and used an HCS-SMLM platform to characterize multiple antibodies targeting T-cell membrane receptors, allowing gathering unprecedented quantitative insight of potential therapeutic candidates. We also optimized the single objective light-sheet microscope (soSPIM) to permit 3D mapping of membrane receptors across an entire T-cell, with single molecule resolution. It allows 3D nanoscale imaging of T-cells in more physiological conditions, and provide complementary information compared to large scale single molecule screening experiments. Altogether, these developments improved our comprehension of antibody mode of action on receptors at the single cell level. Large-scale experiments performed during this work required the development of several software for the automation of the acquisition and the statistical analysis of the Terabytes of single molecule data generated.This project is focused on targeting PD-1, a control point of the immune system involved in the modulation of immune cells activation. The first part of the thesis was mainly devoted to the implementation of new protocols for PD-1 receptors super-resolution imaging on activated Jurkat cells. In the second part, we further investigated the impact of known anti-PD-1 therapeutic antibodies used in clinics, on the nanoscale spatial organization and dynamics of PD-1 receptors in living cells using our HCS-SMLM platform. This work provides the proof of concept of the capacity of these cutting-edge imaging techniques to characterize quantitatively different therapeutic monoclonal antibodies targeting PD-1 on T-cell membrane.


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