Etudes mécanistiques des hydrogénases A FeFe par électrochimie

Mechanistic studies of FeFe hydrogenases by electrochemistry : inhibition by cysteine and hydrogen sulfide, intramolecular diffusion and maturation

• Auteur / Autrice : Christina Felbek
• Direction : Christophe Léger
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences Chimiques
• Date : Soutenance le 18/11/2021
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole èdoctorale Sciences Chimiques (Marseille ; 1996-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Bioénergétique et Ingénierie des Protéines (Marseille ; 2012-....)
• Jury : Président / Présidente : Ariane Jalila Simaan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Manon Guille, Maylis Orio
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Silke Leimkuhler, Yvain Nicolet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chimie bioinorganique

Composés de coordination

Hydrogénases

Hydrogène

Cinétique enzymatique

Catalyse

Électrochimie

Mots clés libres

Électrochimie

Catalyse

Cinétique enzymatique

Hydrogène

Hydrogénases

Chimie de coordination

Chimie bioinorganique

Electrochemistry

Catalysis

Enzyme kinetics

Hydrogen

Hydrogenases

Coordination chemistry

Bioinorganic chemistry

Résumé

Les hydrogénases de type "FeFe" sont des enzymes qui catalysent l’oxydation et la production de H2. Leur réactivité est liée à une position de coordination vacante sur l’un des ions Fe (Fed) du sous-cluster 2Fe de leur site actif. Fed est la cible de l’inhibiteur O2, qui endommage l'enzyme.L’oxydation de l’enzyme en présence de H2S forme l’état Hinact, dans lequel l'enzyme est résistante à O2. Dans cet état inactif, Fed est coordonné par un ligand HS- qui empêche l’attaque de O2. Nous avons étudié le mécanisme de formation réversible de Hinact en utilisant l’électrochimie de films protéiques (PFE) et des calculs de type dynamique moléculaire et DFT.Nous avons aussi étudié la formation de Hinact indépendante de H2S dans l’hydrogénase de C. beijerinckii. En combinant PFE, FTIR, cristallographie et mutagénèse dirigée, nous avons montré que Hinact est formé dans ce cas par la coordination à Fed d’une cystéine conservée. Des résidus non conservés distants du site actif permettent la translocation de cette cystéine.Nous avons par ailleurs caractérisé les propriétés cinétiques d’une hydrogénase de D. fructosovorans, ainsi que des mutants de l’hydrogénase de C. reinhardtii conçus dans le but de ralentir la diffusion intramoléculaire des petites molécules.Nous avons enfin étudié la dernière étape de la maturation de l’enzyme–l’insertion du sous-cluster 2Fe–au sein d’un film de polymères rédox.En résumé, par une approche multidisciplinaire combinant PFE, biologie moléculaire, biochimie et approches théoriques, nous avons avancé la compréhension des mécanismes de protection des hydrogénases contre O2 ainsi que des effets à longue distance de résidus sur la chimie du site actif.

FeFe hydrogenases are enzymes that catalyse the oxidation and production of hydrogen.Their reactivity is in particular linked to a free coordination site (Fed) on the 2Fe cluster of their active site. O2 binding to Fed damages the enzymes, which is a major issue for their application.Oxidation in the presence of H2S makes FeFe hydrogenases resistant to oxygen by formation of the so-called inactive Hinact state, in which Fed is coordinated by a HS- ligand that prevents O2 attack. We describe the mechanism of reversible formation of Hinact in detail, by combining protein film electrochemistry (PFE), and MD and DFT calculations.Furthermore, we studied the reversible, sulfide-independant formation of the same Hinact state in the FeFe hydrogenase from C. beijerinckii using PFE, FTIR, XR crystallography and site-directed mutagenesis. We discovered that a conserved cysteine coordinates to Fed in Hinact. Non-conserved amino acids 13 Å away from Fed enable cysteine translocation, and thus remotely control active site chemistry.We also characterised the kinetic properties of the bifurcating hydrogenase from D. fructosovorans as well as mutants of the hydrogenase from C. reinhardtii designed to influence intramolecular gas diffusion.Finally, we probed the last step of the enzyme maturation –the insertion of the 2Fe cluster into the apo-enzyme– in a redox polymer film.In summary, using a multidisciplinary approach that combines electrochemistry, molecular biology, biochemistry and theoretical methods, we advanced the understanding of oxygen protection mechanisms in FeFe hydrogenases. We also demonstrated the long range influence of several residues on the active site chemistry.