Mise en évidence d’une interaction entre la protéine 53BP1 et les fragments d’Okazaki

53BP1 is an RNA Binding Protein that Directly Interacts with Okazaki Fragments

• Auteur / Autrice : Mélissa Leriche
• Direction : Stephan Vagner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 19/05/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome, ARN et cancer (2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Simon Saule
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stefania Millevoi, Béatrice Eymin, Olivier Sordet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stefania Millevoi, Béatrice Eymin

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN -- Réplication

Protéines de liaison à l'ARN

Mots clés libres

Protéines de liaison aux ARN

Réplication de l'ADN

Fragments d'Okazaki

53bp1

RNA-Binding proteins

DNA replication

Okazaki fragments

53bp1

Résumé

Le maintien de l’intégrité du génome est un processus crucial à la vie cellulaire. Ce n’est que récemment que les protéines de liaison à l’ARN (« RNA-binding protein » ou RBP) ont été montré être impliquées dans ce processus. En présence d’ADN endommagé, les RBP régulent l’expression des gènes de réponse aux dommages de l’ADN et contrôlent le destin cellulaire. Elles jouent également un rôle plus direct dans la prévention et la réparation des dommages de l’ADN. De plus, des ARN sont présents aux sites de dommages de l’ADN et participent au maintien de l’intégrité du génome. Ainsi, le laboratoire recherche des acteurs protéiques capables de lier directement l’ARN au sein des protéines médiatrices de la réponse aux dommages de l’ADN. Un des candidats est la protéine 53BP1 (p53 binding protein 1) qui contient un domaine de liaison à l’ARN nommé domaine GAR (« Glycine-Arginine Rich »). 53BP1 est un acteur central de la signalisation des cassures double-brin de l’ADN et de la régulation de leur réparation par le processus de jonction d’extrémités non homologues pendant la phase G1 du cycle cellulaire. Le recrutement de 53BP1 aux sites de dommages de l'ADN dépend à la fois d'interactions directes entre 53BP1 et des marques d’histones, mais aussi d’une composante ARN.L’objectif était d’étudier l’interaction entre 53BP1 et l’ARN.Grâce aux méthodes de CLIP (« CrossLinking and ImmunoPrecipitation ») et de 2C (« Complex Capture »), nous avons montré que 53BP1 possède une activité de liaison directe à l'ARN, via son domaine GAR. Nous avons identifié l’acide nucléique interagissant avec 53BP1 comme étant une chimère ARN-ADN constituée d’une partie d’environ 10 ribonucléotides, suivie d’environ 100 désoxyribonucléotides. Ce type de molécule est très similaire à celle des fragments d’Okazaki qui sont impliqués dans l’initiation de la synthèse du brin retardé de la fourche de réplication. Par la méthode de SIRF (« In Situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks »), nous avons montré que 53BP1 est présent au niveau de l’ADN naissant, dans un contexte de réplication normal. De plus, la déplétion de la sous-unité catalytique de la primase (PRIM1) qui synthétise l’amorce ARN des fragments d’Okazaki, conduit à la diminution de la présence de 53BP1 à proximité d’ADN naissant. La déplétion de PRIM1 affecte également l’interaction de 53BP1 avec la chimère ARN-ADN in vivo. Ces résultats indiquent que 53BP1 est présent à la fourche de réplication via une interaction directe avec les fragments d’Okazaki. Enfin, sous stress réplicatif induit par l’hydroxyurée, la présence de 53BP1 au niveau de l’ADN naissant est fortement augmentée, indiquant que 53BP1 s’accumule aux fourches de réplication bloquées. L'ensemble de ces résultats montre que 53BP1 est une protéine de liaison aux ARN qui interagit directement avec les fragments d’Okazaki.

Maintenance of genome integrity is essential for cell survival. It is only recently that RNA-binding proteins (RBPs) have been shown as fundamental actors in this process. In the presence of DNA damage, RBPs regulate the expression of DNA damage response (DDR) related genes and control cell fate. RBPs also have a more direct role in preventing and repairing DNA damage. Moreover, some RNAs are present at sites of DNA damage and, thus, participate in the maintenance of genome integrity. The laboratory is interested in proteins that are both able to directly bind RNA and involved in DDR. One candidate is the 53BP1 protein (p53 binding protein 1) that contains an RNA-binding domain called GAR domain (Glycin-Arginin Rich). 53BP1 is a key protein mediating the signalling of DNA double-strand breaks and channels DNA repair to the non-homologous end-joining pathway during the G1 phase of the cell cycle. The recruitment of 53BP1 to sites of DNA damage depends on both histones marks and an RNA component.The objective was to study the interaction between 53BP1 and RNA.By using CLIP (CrossLinking and Immunoprecipitation) and 2C (Complex Capture) technologies, we showed that 53BP1 presents a direct RNA-binding activity within its GAR domain. We identified the nucleic acid interacting with 53BP1 as being an RNA-DNA chimera composed of about 10 ribonucleotides, followed by about 100 dexoribonucleotides. This type of entity is highly similar to that of Okazaki fragments, that are involved in the initiation of lagging strand synthesis at replication forks. By using the SIRF method (In Situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks), we showed that 53BP1 is localized at sites of newly synthetized DNA, under normal conditions of replication. Furthermore, depletion of the catalytic sub-unit of the primase (PRIM1), that catalyzes the synthesis of the RNA primer of Okazaki fragments, results in a decrease in 53BP1 at sites of newly synthetized DNA. PRIM1 depletion also decreases the interaction between 53BP1 and RNA-DNA chimera in vivo. These results indicate that 53BP1 is localized at the replication fork through a direct interaction with Okazaki fragments. Likewise, under replicative stress induced by hydroxyurea, the presence of 53BP1 at the newly synthetized DNA is increased, indicating that 53BP1 accumulates at stalled replication forks. Altogether, these results show that 53BP1 is an RNA-binding protein that directly interacts with Okazaki fragments.