Contrôle de l’expansion ex vivo de précurseurs kératinocytaires humains fonctionnels : implication des facteurs de transcription KLF4 et MAD4

Control of the Ex Vivo Expansion of Functionnal Human Keratinocyte Precursor Cells : Implication of KLF4 and MAD4 Transcription Factors

• Auteur / Autrice : Julien Coutier
• Direction : Michèle Martin, Nicolas Fortunel, Jean-Jacques Lataillade
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 13/01/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de génomique et radiobiologie du kératinocyte - France. Direction générale de l'armement
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Annelise Bennaceur-Griscelli
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yves Poumay, Michel Simon, Christine Baldeschi
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Yves Poumay, Michel Simon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Facteurs de transcription

Facteurs de transcription Krüppel-like

Dissertation universitaire

Régénération de la peau par traitement au plasma

Cellules souches

Kératinocytes

Mots clés libres

Klf4

Keratinocytes

Mxd4

Epiderme

Cellule souche

Régénération

Mxd4

Epidermis

Regeneration

Keratinocytes

Klf4

Stem cell

Résumé

Dans le contexte de la médecine régénérative cutanée, l’amplification massive en culture de précurseurs kératinocytaires est souvent requise mais elle peut s’accompagner d’une induction de la différenciation conduisant à une perte de potentiel régénératif. L’expansion ex vivo de précurseurs fonctionnels nécessite de contrôler deux processus : d’une part l’activation de la prolifération et d’autre part la préservation de l’immaturité. Mon laboratoire d’accueil a identifié les gènes KLF4 et MXD4 comme candidats potentiels dans le contrôle de ces processus. Mon travail de thèse a porté sur l’étude du rôle de KLF4 et MXD4 dans le contrôle des balances « quiescence/prolifération » et « immaturité/différenciation » au sein des précurseurs kératinocytaires de la peau humaine.Nous montrons que la répression de KLF4 comme celle de MXD4 inhibe la différenciation kératinocytaire et augmente la prolifération et la clonogénicité des précurseurs, aboutissant à un potentiel régénératif accru dans des modèles de reconstruction épidermique in vitro et pour KLF4 de xénogreffes in vivo. Les mécanismes des effets liés à KLF4 passent notamment par l’inhibition de la voie du TGFB1 et par la voie Wnt/β-caténine. Les effets liés à MXD4 sont contrôlés par la quantité de dimères c-MYC/MAX et MAD4/MAX, et impactent la voie TGF-β. Malgré des mécanismes partiellement similaires, l’intervention d’effecteurs épigénétiques non codants pourrait conférer des spécificités à chacun de ces deux gènes : des ARN long non-codants, qui pourraient réguler le caractère immature des précurseurs kératinocytaires, ont été identifiés.Notre concept a été démontré initialement en utilisant des outils de recherche, et notamment des inhibitions stables de l’expression de KLF4 et MXD4. Nous montrons également qu’une inhibition transitoire, donc applicable à un contexte clinique, est également fonctionnelle, en utilisant l’ARN interférence ou une inhibition moléculaire. La répression par la kenpaullone pourrait notamment constituer un outil prometteur pour promouvoir l’expansion de précurseurs épithéliaux fonctionnels.

In the context of cutaneous regenerative medicine, massive amplification of keratinocyte precursor cells is usually required but can be accompanied with induction of differentiation, resulting in a loss of regenerative potential. Ex vivo expansion of functional precursors needs to control two processes : to activate proliferation in one hand, and to preserves immaturity in the other hand. My host laboratory has identified KLF4 and MXD4 genes as candidates that might control these processes. My thesis was focused on studying KLF4 and MXD4 roles in controlling the balance “quiescence/proliferation” and “immaturity/differentiation” of human skin keratinocytes precursors.We have shown that repression of KLF4 and MXD4 inhibits keratinocyte differentiation and increases proliferation and clonogenicity of precursors, resulting in enhanced regenerative potential in in vitro epidermis reconstruction assay, and for KLF4, in in vivo xenografts assays. Mechanisms of the effects linked to KLF4 include inhibition of TGFB1 pathway and Wnt/β-catenin pathway. Effects linked to MXD4 are controlled by the respective quantity of c-MYC/MAX and MAD4/MAX heterodimers, and also impact TGF-β pathway. Despite partially similar mechanisms, intervention of non-coding epigenetic factors might confer the specific regulation to each of these genes : long non-coding RNA, that might regulate immature character of keratinocytes precursor cells, have been identified.Our concept has been initially demonstrated using research tools, in particular stable repression of KLF4 and MXD4. We then show that a transient inhibition, applicable to a clinical context, is also functional, by using RNA interference or molecular inhibition. KLF4 and MXD4 transient repression by kenpaullone might constitutes a promising molecular tool to promotes ex vivo expansion of functional epithelial precursor cells.