Auto-assemblage du Lanréotide - rôle des sels et des contre-ions

Lanreotide self-assembly - role of salts and counterions

• Auteur / Autrice : Cristina Petcut
• Direction : Marie-Thérèse Paternostre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 03/12/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Human Rezaei
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Chassenieux, Lucie Paÿloune Khemtemourian, Franck Artzner
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christophe Chassenieux, Lucie Paÿloune Khemtemourian

Mots clés

Mots clés contrôlés

Peptides

Membranes (biologie)

Sels

Autoassemblage

Mots clés libres

Auto-Assemblage

Peptide dicationique

Contre-Ions

Sels

Membrane

Déstabilisation

Self-Assembly

Dicationic peptide

Counterions

Salts

Membrane

Destabilization

Résumé

L’acétate de Lanréotide est un oligopeptide thérapeutique, analogue de la somatostatine. Ce peptide di-cationique, au-dessus d’une concentration critique d’assemblage (CAC), s’auto-assemble spontanément dans l’eau en formant des nanotubes supramoléculaires très bien ordonnés. Ces architectures spontanées sont directement utilisées dans la formulation à libération prolongée de ce peptide, la somatuline Autogel®. La compréhension des mécanismes d’assemblage ainsi que de l’influence des milieux sur ces assemblages peptidiques sont importants pour comprendre l’évolution au cours du temps de cette formulation après injection sous la peau. Les interactions électrostatiques entre peptides et contre-ions et les répulsions électrostatiques entre peptides jouent des rôles potentiellement importants (stabilisants ou déstabilisants) sur les assemblages finaux. Un premier objectif de ce travail était donc de comprendre comment la nature des sels (cations mono-, di- & multivalents, anions mono- & divalents ou encore des acides gras de longueurs de chaîne croissantes) influençait l’auto-assemblage du Lanréotide. Les cations mono, di- ou multivalents et les anions monovalents diminuent la CAC du Lanréotide mais ont peu d’effet sur la structure des assemblages. Les anions divalents provoquent l’emboîtement des nanotubes. Le nombre de nanotubes emboîtés dépend de la nature du dianion. Un second objectif de ce travail était de comprendre dans quelles conditions l’interaction électrostatique forte qui se met en place entre le Lanréotide et des membranes lipidiques chargées négativement pouvait être déstabilisée. Il avait été précédemment montré que le Lanréotide en contact avec ces membranes s’auto-assemble à leur surface à des concentrations très faibles et interagit jusqu’à saturer la surface membranaire. Au-delà de la saturation des membranes, le Lanréotide en excès en solution se comporte comme le peptide pur en solution. Nous montrons dans ce travail que des sels monovalents ne déplacent pas le Lanréotide de la surface des bicouches lipidiques, des sels divalents le déplacent partiellement et seuls des polymères fortement chargés sont capables de déplacer le Lanréotide entièrement de la surface membranaire. Ces observations confirment l’hypothèse qui avait été faite selon laquelle l’interaction entre Lanréotide et membrane ne peut s’expliquer par une interaction simple entre ion et contre-ion, mais plutôt comme une interaction entre polyelectrolytes. Ces travaux ont été réalisés en combinant ultrafiltration, spectroscopie ATR-FTIR, microscopie électronique (coloration négative ou après cryofracture), diffusion de rayons X pour obtenir des informations sur les concentrations critiques d’assemblage du peptide, sa conformation, la morphologie ainsi que la structure moléculaire et supramoléculaire des architectures auto-assemblées.

Lanreotide acetate is a therapeutic oligopeptide, analog of somatostatin. This di-cationic peptide, above a critical assembly concentration (CAC), spontaneously self-assembles in water, forming very well ordered supramolecular nanotubes. These spontaneous architectures are directly used in the sustained release formulation of this peptide, somatulin Autogel®. Understanding the assembly mechanisms as well as the influence of media on these peptide assemblies is important for understanding the evolution over time of this formulation after injection under the skin. Electrostatic interactions between peptides and counterions and electrostatic repulsions between peptides play potentially important roles (stabilizing or destabilizing) on the final assemblies. A first objective of this work was therefore to understand how the nature of the salts (mono-, di- & multivalent cations, mono- & divalent anions or even fatty acids of increasing chain lengths) influenced the self-assembly of Lanreotide. Mono, di- or multivalent cations and monovalent anions decrease the CAC of Lanreotide, but have little effect on the structure of assemblies. The divalent anions cause the embedding of the nanotubes. The number of embedded nanotubes depends on the nature of the dianion. A second objective of this work was to understand under which conditions the strong electrostatic interaction that takes place between Lanreotide and negatively charged lipid membranes could be destabilized. It had previously been shown that Lanreotide in contact with these membranes self-assembles at their surface at very low concentrations and interacts to saturate the membrane surface. Beyond the saturation of the membranes, the excess Lanreotide in solution behaves like the pure peptide in solution. In this work, we show that monovalent salts do not displace Lanreotide from the surface of lipid bilayers, divalent salts partially displace it and only highly charged polymers are able to displace Lanreotide entirely from the membrane surface. These observations confirm the hypothesis that had been made that the interaction between Lanreotide and membrane cannot be explained by a simple ion-counterion interaction, but rather as an interaction between polyelectrolytes. This work was carried out by combining ultrafiltration, ATR-FTIR spectroscopy, electron microscopy (negative staining or freeze-fracture), X-ray scattering to obtain information on the critical assembly concentrations of the peptide, its conformation, morphology as well as the molecular and supramolecular structure of self-assembled architectures.