Exploration fonctionnelle des gènes précoces du bactériophage T5 dans la prise de contrôle de l’hôte : vers des nouvelles stratégies antibactériennes ?

Functional exploration of bacteriophage T5 pre-early genes in the host takeover : a route towards new antibacterial strategies ?

• Auteur / Autrice : Luis Maria Ramirez chamorro
• Direction : Pascale Boulanger, Ombeline de La Rochefoucauld-Rossier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 11/12/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Olga Soutourina
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mart Krupovic, Rob Lavigne, David Bikard, Marie-Agnès Petit, Frédérique Le Roux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mart Krupovic, Rob Lavigne

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dissertation universitaire

Gènes précoces

Génie génétique

Bactériophages

Mots clés libres

Bactériophages

Transport de l'ADN

Ingénierie des génomes

Gènes précoces

Bacteriophages

DNA transport

Genome engineering

Early genes

Résumé

Les bactériophages (phages) sont les virus qui infectent les bactéries. Au début de l'infection, ils inactivent les défenses bactériennes et détournent les fonctions cellulaires à leur profit pour produire de nouveaux virions. Les stratégies qu’ils utilisent pour prendre le contrôle de leur hôte ont été étudiées chez très peu de phages. Une limite à ces études est due à la diversité des gènes précoces exprimés lors des premières étapes de l'infection, qui le plus souvent n’ont pas d’homologues détectables ni de fonction connue. Or, ils représentent une source importante de nouveaux gènes dont les produits sont essentiels pour la neutralisation de l'hôte. La découverte de leur fonction est donc cruciale pour décrypter les mécanismes de prise de contrôle de l'hôte et pour identifier les fonctions bactériennes ciblées par les protéines des phages.T5 est un phage virulent qui infecte Escherichia coli en utilisant un mode d’injection de son génome en deux étapes. Il transfère d’abord 8 % de son ADN et l’injection s'arrête. Ce fragment, appelé locus FST (First Step Transfer), code pour 17 protéines précoces qui inhibent les mécanismes de défense bactérienne, induisent la dégradation de l'ADN de l'hôte, stoppent la synthèse des protéines de l'hôte et redémarrent le transfert de l'ADN viral. Le génome complet est alors injecté, permettant la réplication de l'ADN et l'assemblage des particules virales, puis la lyse de la bactérie. Seuls trois gènes ont été étudiés dans le passé : dmp, gène non essentiel pour l'infection codant pour une phosphatase ; A1 et A2, deux gènes nécessaires pour la deuxième étape de transfert de l'ADN. A1 est également impliquée dans la dégradation de l'ADN de l'hôte. Les 14 autres gènes précoces sont des gènes dits ''ORFphelins'' dont les fonctions sont inconnues. Ce mécanisme original d’injection de l'ADN en deux étapes, associé au regroupement des gènes précoces dans le locus FST, fait de T5 un modèle privilégié pour étudier les premiers événements de l'infection par les phages.Cette thèse porte sur l'étude fonctionnelle du locus FST du phage T5. Pour comprendre le rôle des gènes précoces de T5, nous avons d'abord développé des outils de génétique inverse. Une méthode alternative à l'utilisation du système CRISPR/Cas a été mise au point avec T5, permettant de modifier les génomes de phages virulents qui ''résistent'' aux nucléases CRISPR/Cas. Ces stratégies ont permis d'obtenir des mutants portant des délétions simples ou multiples des gènes précoces et d'évaluer leur impact sur l'infection. La délétion de certains gènes a entraîné des modifications de la production virale, de la latence et de la virulence des mutants testés. La délétion du gène dmp est celle qui altère le plus l'infection, de manière comparable aux délétions multiples. Un phage T5 avec un locus FST minimal a pu être construit, suggérant que seuls quelques gènes précoces - dont A1 et A2 - sont nécessaires pour l’infection. Enfin, pour explorer la fonction des gènes précoces de T5, nous avons étudié l'impact de leur expression sur la bactérie E. coli, en dehors du contexte infectieux. Les produits de certains gènes sont toxiques et altèrent la croissance bactérienne, produisant des perturbations de la morphologie cellulaire ou du nucléoïde bactérien, voire induisant une lyse cellulaire. Ces résultats suggèrent que certaines protéines précoces interfèrent avec la division cellulaire, le métabolisme de l'ADN ou l'intégrité des membranes. Il est important de noter que la capacité de A1 à déclencher la destruction massive du chromosome bactérien a été observée en l'absence d'infection.Cette exploration des premières étapes de l'infection par T5 ouvre maintenant la voie vers la caractérisation fonctionnelle et structurale des protéines précoces qui « domestiquent » l'hôte au profit de la production virale et pourraient déboucher sur la conception de nouveaux agents antimicrobiens.

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria. In the early stages of infection, they defeat bacterial defenses and hijack cellular functions to produce new viral particles. Their strategies to take over host cell resources remain poorly understood and have only been studied in a limited number of phages. Importantly, phage genes expressed early during infection are highly diverse from one phage to another and most have no assigned function yet. They represent a library of novel genes whose products are crucial for host neutralization; therefore, elucidating their function is essential for deciphering the mechanisms of host takeover and identifying host factors targeted by phage proteins.T5 is a virulent phage that infects Escherichia coli in two steps. First, it delivers 8 % of its linear DNA and the genome transfer stops. This fragment, called the First Step Transfer (FST) locus, encodes 17 pre-early proteins that inhibit bacterial defense mechanisms, promote host DNA degradation, stop host protein synthesis and promote the resumption of viral DNA delivery. Then, the rest of the genome enters, enabling DNA replication and viral particle assembly and subsequent release through lysis. Only three pre-early genes were studied in the past: dmp encodes a phosphatase that is dispensable for infection, A1 and A2 are two genes required for the second-step transfer of DNA, and A1 is also involved in host DNA degradation. The remaining 14 pre-early genes are “ORFan” genes with unknown functions. Together with this original 2-step DNA injection, the clustering of the pre-early genes makes T5 an attractive model to investigate the early events of infection.This study focused on the functional investigation of the FST locus of T5. In order to uncover the role of pre-early genes in host takeover, we first developed reverse genetic tools for editing the T5 genome. Alternatives to the use of the CRISPR/Cas system were set up for T5 genome engineering, which include an attractive method to modify genomes of virulent phages that “resist” CRISPR/Cas nucleases. Through these strategies, single and multiple pre-early gene deletion mutants were obtained, that allowed to assess the significance of pre-early genes for infection. Deletion of some pre-early genes led to alterations in burst size, latency and virulence of the mutants tested. Among them, deletion of the dmp gene resulted in the strongest alteration of infection, similar to multiple deletion mutants. A bacteriophage with a minimal FST locus could be constructed, which suggests that only very few pre-early genes - including both A1 and A2 - are required for the host takeover process by T5. Finally, to further explore the function of all T5 pre-early genes, we investigated the impact of their expression on host cells in the absence of other viral factors. Some gene products were toxic for the host and altered bacterial growth, producing strong perturbations of the cell morphology or the nucleoid layout, or even inducing cell lysis. These results suggest that some pre-early proteins interfere with cell division, DNA metabolism or membrane integrity. Importantly, the ability of A1 to trigger the massive destruction of the bacterial chromosome in the absence of infection was unraveled.This exploration of the main events of T5 infection now calls for further functional and structural investigations of the pre-early proteins, which are crucial for host neutralization and thus might eventually inspire the design of new antimicrobial drugs.