Thèse soutenue

Développement d’une méthode de mesure et d’analyse du transport intraneuronal dans le cerveau de larve de poissons-zèbre par suivi de nanocristaux non-linéaires en microscopie de second-harmonique : application à l’étude d’anomalies de transport chez des poissons portant une mutation retrouvée dans des neuropathies humaines.

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Auteur / Autrice : Fériel Terras
Direction : François Treussart
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Optique et photonique
Date : Soutenance le 13/10/2020
Etablissement(s) : université Paris-Saclay
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ondes et matière (Orsay, Essonne ; 2015-....)
Partenaire(s) de recherche : Référent : École normale supérieure Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 1912-....)
Laboratoire : Laboratoire Lumière, matière et interfaces (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2020-...)
Jury : Président / Présidente : Rachel Méallet-Renault
Examinateurs / Examinatrices : Lydia Danglot, Cédric Bouzigues, Claire Wyart, François Marquier
Rapporteur / Rapporteuse : Lydia Danglot, Cédric Bouzigues

Résumé

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Le transport moléculaire dans les neurones joue un rôle essentiel dans leur développement et la maintenance de leurs fonctions, en raison notamment de leurs longues arborescences. Les conséquences d’anomalies du transport axonal ont été associées de longue date à la maladie d’Alzheimer telle que le gonflement des axones consécutif à l’accumulation des organelles transportés, mais il y a peu d’outils permettant l’étude fine sur le long terme de ce transport en culture et encore moins in vivo.L’équipe dans laquelle cette thèse a été réalisée a développé une méthode de mesure du transport intraneuronal en culture de neurone de souris reposant sur le suivi d’endosomes ayant internalisé spontanément des nanodiamants fluorescents. Elle a également démontré la grande sensibilité de cette méthode à détecter des facteurs de risques génétiques de maladies neuropsychiatriques.L’objectif de ma thèse a été d’étendre cette méthode de mesure au circuit neuronal intègre du cerveau de larves de poisson zèbre. Pour ce faire j’ai utilisé des nanocristaux (NCs) à réponse optique non-linéaires, pouvant être excité dans une fenêtre de transparence des tissus, à une longueur d’onde ≈1 µm, et générant un signal de second harmonique (SHG). Nous avons utilisé le microscope multiphoton de la plateforme Emerg’In (INRAE, Jouy-en-Josas) qui est installée au sein d’une pisciculture et dispose de scanners galvanométriques résonants et de détecteurs hybrides, ce qui nous a permis de maintenir une cadence de 20 champs par seconde malgré la nécessité de balayer le faisceau laser, contrairement aux études en culture, menées en champ large.Nous avons mis au point un nouveau protocole de mesure, depuis l’injection des NC jusqu’à l’extraction des paramètres de transport à partir des données vidéos. Pour cela, j’ai optimisé et automatisé les analyses des données en développant deux programmes écrits en Python : l’un permettant de reconstruire automatiquement les trajectoires des NCs de manière la plus fidèle possible et l’autre permettant de segmenter les trajectoires en phases de mouvement et de pauses afin d’en extraire des paramètres de transport.J’ai appliqué ces nouveaux outils à l’étude, sur un modèle transgénique de poisson zèbre, de l’impact fonctionnel d’une mutation présente dans des neuropathies dont une paraplégie spastique héréditaire et la maladie de Charcot-Marie-Tooth périphérique. Chez des patients atteints par l’une de ces maladies, plusieurs mutations ont été identifiées sur le gène KIF5A codant pour la chaine lourde du moteur moléculaire kinésine 1 qui assure des déplacements antérogrades (du corps cellulaire vers la périphérie). Nous avons mesuré le transport d’endosomes dans les axones de neurones du cerveau de larve de poissons zèbres transgéniques portant une mutation sur kif5a, et avons observé des modifications subtiles de ce transport. Pour cela, plus de 500 trajectoires d’endosomes (acquises à une profondeur de ≈100 µm sous la surface de la tête) ont été analysées, issues de 40 larves.En guise de contrôle, nous avons également étudié le transport endosomal dans des mutants privés des moteurs dynéines, les seuls à assurer le transport rétrograde, et avons observé que le transport bidirectionnel était totalement arrêté dans les mutants.La méthodologie mise en place peut servir à cribler des anomalies fonctionnelles résultant de facteurs génétiques de troubles neurologiques ou neurodégénératifs.