Etude des mécanismes moléculaires induits par l’activation de la voie de signalisation NOTCH2 dans les lymphomes B de la zone marginale de la rate (SMZL)

Study of Molecular Mechanisms Induced by NOTCH2 Signaling Activation in Splenic Marginal Zone Lymphoma (SMZL)

• Auteur / Autrice : Mylène Bun
• Direction : Camille Lobry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 18/12/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique moléculaire de la transformation hématopoïétique (Villejuif, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Thomas Mercher
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuelle Clappier, Ludovic Deriano, Dominique Bluteau, Raphaël Itzykson, Olivier Kosmider
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Emmanuelle Clappier, Ludovic Deriano

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phénomènes physiologiques cellulaires

Survie cellulaire

Gènes myc

Transcriptome

Récepteur Notch2

Lymphome B de la zone marginale

génétique

étiologie

Tumeurs spléniques

Cancer -- Étiologie

Rate

Mots clés libres

Lymphome

Transcription

ARNlnc

Épigénétique

Notch

Notch

Transcription

LncRNA

Lymphoma

Epigenetic

Résumé

Le lymphome B de la zone marginale de la rate (SMZL) est un lymphome non-hodgkinien qui touche principalement les sujets âgés (65 ans). Ce type de lymphome de B de la zone marginale se caractérise par une prolifération aberrante des lymphocytes B de la zone marginale de la rate. Cette sur-prolifération entraîne chez les patients une splénomégalie, une cytopénie, une thrombocytose et dans 15% des cas, une manifestation auto-immune. A ce jour, il n’existe aucun traitement spécifique. Des études basées sur les analyses mutationnelles sur les patients ont permis de mettre en évidence une mutation spécifique et récurrente dans 25% des cas, au niveau de la voie de signalisation NOTCH2. Cette mutation est une mutation qui tronque le domaine PEST, indispensable pour la dégradation du domaine intracellulaire de NOTCH2 et donc à l’arrêt de celle-ci. Ainsi, cette mutation somatique gain-de-fonction entraîne une sur-activation de l’activité de NOTCH2 dans les lymphocytes B de la zone marginale de la rate. Les mécanismes moléculaires induits par l’activation de la voie NOTCH2 dans la pathogenèse ne sont pas clairs. Par conséquent, identifier les gènes cibles directs de NOTCH2 pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires induits par NOTCH2 et donc permettrait l’établissement d’une thérapie ciblée pour traiter ces patients mutés de la voie NOTCH2. Tout au long de ma thèse, j’ai cherché à identifier les gènes cibles directs de la voie de NOTCH2 induits dans ce type de lymphome B. Dans un premier temps, j’ai caractérisé une lignée cellulaire SMZL : Ri-1. Puis, afin d’identifier les changements transcriptionnels induits par NOTCH2, j’ai effectué un séquençage d’ARN (RNA-seq) sur trois conditions différentes. Ces données nous ont permis d’identifier l’oncogène MYC comme étant potentiellement un gène cible direct de NOTCH2. A côté de cela, afin d’identifier les facteurs épigénétiques associés aux oncogènes, nous avons effectué un crible de shRNA. Nous avons mis en évidence une répression significative de l’expression de MYC dans ces cellules. Afin de confirmer ces résultats et d’identifier le rôle fonctionnel de MYC dans ces cellules, j’ai inhibé l’expression de MYC à l’aide de shRNA. Ces données sont cohérentes avec les résultats du crible, lorsque MYC est inhibé dans ces cellules, cela entraîne une mort cellulaire. Ainsi, nous avons conclu que MYC est requis pour la prolifération et la croissance des cellules cancéreuses. J’ai par la suite, effectué une expérience de complémentation fonctionnelle. J’ai forcé l’expression endogène de MYC grâce à la technologie du CRISPRa dans les conditions où l’activité de NOTCH2 est inhibée. Nous avons mis en évidence une restauration de la survie cellulaire lorsque MYC est exprimé dans les conditions où la voie NOTCH2 est inhibée. Ainsi, cette étude nous a permis de démontrer que l’induction de MYC est essentielle à prolifération, à la croissance et à la survie des cellules cancéreuses. De plus, identifier MYC comme étant un gène cible direct de NOTCH2, nous permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires induits dans la pathogenèse de celui-ci.

Splenic marginal zone lymphoma (SMZL) is a indoldent B-cell neoplasm lymphoma involving the spleen and bone marrow that affects mostly old people (65 yo). SMZL patients manifest a splenomegaly and a cytopenia. In 15% of the case, autoimmune manifestations are found. Studies based on mutational analysis have highlighted a specific and recurrent mutation in 25% of the case in NOTCH2 signaling pathway. This mutation truncates the PEST domain, which is crucial for NOTCH2 intracellular domain degradation, and so the activation arrest. Hence this somatic gain-of-function mutation leads to an over-activation of NOTCH2 signaling in SMZL. Molecular mechanisms induced by NOTCH2 in the pathogenesis remains unclear. Therefore, identifying NOTCH2 direct target genes may allow establishment of targeted therapies to treat SMZL patients mutated in NOTCH2 signaling. All along my PhD study, I aimed to identify NOTCH2 direct target genes induced in SMZL. First, I characterized Ri-1 cell line as a relevant cell model for my study. Then, to identify transcriptional changes induced by NOTCH2 in SMZL, RNA-seq was performed. From these data, among genes that were significantly re-expressed, I identified the oncogene MYC as a potential NOTCH2 direct target gene. Beside, to probe epigenetic factors associated with oncogenes, ShRNA screen was performed. We have highlighted that MYC expression was significantly repressed. To confirm these data, MYC depletion was done using ShMYC. These data are consistent with the shRNA screen data. When MYC expression is repressed, there is a significant decrease of cell proliferation and growth. To validate these data, an MYC-independent NOTCH2 expression was endogenously induced using CRISPRa technology in the condition where NOTCH2 activity is inhibited. We have demonstrated that MYC –independent NOTCH2 expression restores cancer cell survival when NOTCH2 activity is repressed. Hence, in this study, I showed that MYC expression is required for cell growth, cell proliferation and cell survival. Moreover, identifying MYC as a potential NOTCH2 direct target gene allows a better understanding of molecular mechanisms induced in SMZL pathogenesis.