Caractérisation de la réponse à l’immunothérapie sur puce microfluidique dans un modèle de cancer du poumon

Lung Cancer On-Chip for Immunotherapy Response Profiling

• Auteur / Autrice : Irina Veith
• Direction : Maria-Carla Parrini
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 23/11/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer, Hétérogénéité, Instabilité et Plasticité
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Eric Deutsch
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuel Donnadieu, Pablo Vargas, Eliane Piaggio, Nicolas Girard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Emmanuel Donnadieu, Pablo Vargas

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tests de criblage d'agents antitumoraux

Laboratoires sur puces

Microenvironnement tumoral

Médecine de précision

Microfluidique

Immunothérapie anticancéreuse

Poumon

Immunothérapie

Poumon -- Cancer non à petites cellules

Cancérologie

Mots clés libres

Cancérologie

Immunothérapie

Médecine de précision

Microfluidique

Tumeurs-Sur-Puce

Cancerology

Immunotherapy

Precision medicine

Microfluidics

Tumors-On-Chip

Résumé

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est l'une des rares maladies tumorales, avec mélanome et carcinome vésical, pour lesquelles les médicaments immuno-oncologiques ont conduit à une révolution thérapeutique. Seuls 20 à 30% des patients atteints de CPNPC bénéficient de la monothérapie avec inhibiteurs des points de contrôle immunitaires (ICP) avec des réponses durables, tandis que les combinaisons ont conduit à réponse longue dans jusqu'à 40% des patients. Notre étude vise à mieux caractériser la modulation du microenvironnement tumoral lors d'un traitement ICP, plus ou moins une chimiothérapie concomitante, afin de guider des stratégies d'immunothérapie plus convaincantes. Inspiré par la technologie d'organes sur puce, nous avons reconstitué ex vivo un microenvironnement de tumeur pulmonaire immunocompétent simplifié en réalisant des co-cultures 3D dans des dispositifs microfluidiques. Cette approche nous a permis de réaliser une imagerie en direct et une quantification des effets de l'ICP sur l'écosystème tumoral. L’architecture de la puce se compose de trois micro-chambres parallèles, séparées par des micro-piliers qui permettent le confinement d'un hydrogel biomimétique dans le canal central par capillarité. En co-cultivant des cellules CPNPC et des lymphocytes T cytotoxiques autologues (récoltés à partir des TIL du même patient et amplifiés ultérieurement in vitro), nous pourrions récapituler, visualiser et quantifier une activité cytotoxique efficace et spécifique des cellules T contre les cellules cancéreuses autologues. Pour cela, nous avons développé un nouvel algorithme qui pourrait localiser les cellules cancéreuses et, grâce à un rapporteur fluorescent de l'activité caspase, mesurer leur mort d'une manière spécifique au temps et à l'espace. Dans ces co-cultures 3D, l'activité cytotoxique des cellules T a été renforcée par le traitement avec l'inhibiteur PD-1 et l'inhibiteur PD-L1, reconstituant ainsi sur puce une réponse ICI. De plus, cette méthode nous a permis d'extraire un paramètre, le potentiel d'induction de la mort, qui estime mathématiquement la «contagiosité de la mort» en calculant la proximité dans l'espace et le temps des signaux de mort. Fait intéressant, cette analyse nous a révélé que la mort des cellules cancéreuses causée par la chimiothérapie ou par les cellules T cytotoxiques est contagieuse, alors que dans les conditions témoins, la mort des cellules cancéreuses est stochastique. Cette observation peut avoir des implications biologiques et cliniques, par exemple en ce qui concerne « l'effet spectateur », observé après un traitement de radiothérapie. De plus, afin d'avoir un aperçu moléculaire de l'impact de la co-culture sur les cellules T, en présence ou en l'absence d'ICI, nous avons analysé par cytométrie de flux l'expression de plusieurs marqueurs de cellules T. Après 3 jours de co-culture sur puce, les lymphocytes T ont montré une expression accrue des marqueurs d'activation, tels que CD69 et CD25, ainsi qu'une augmentation de l’expression des marqueurs d'épuisement, notamment PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG- 3, CD137 et OX-40. Le couplage de l'analyse d'image et de l'étude de la plasticité des lymphocytes T, nous a permis d'associer pour la première fois l'activité cytotoxique finement quantifiée des lymphocytes T avec leur statut d'activation / épuisement et de décrire un phénotype réactif aux immunothérapies. Dans cette thèse, nous avons démontré que la tumeur-sur-puce peut être exploité pour évaluer l'efficacité des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires, potentiellement pour déterminer l'effet de médicaments combinés et enfin pour étudier les mécanismes de résistance primaire des cellules cancéreuses.

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is one of the few tumor diseases, with melanoma and vesical carcinoma, for which immuno-oncology drugs led to a therapeutic revolution. Only 20 to 30% of the NSCLC patients benefit from immune checkpoint inhibitors (ICI) monotherapy with durable responses, while combinations led up to 40% of long responder patients. Our study aims to better characterize the modulation of the tumor microenvironment upon ICI treatment, plus or minus concurrent chemotherapy, in order to guide more compelling immunotherapy strategies. Inspired by the organ-on-a-chip technology, we implemented the reconstitution ex vivo of a simplified immunocompetent lung tumor microenvironment by performing 3D co-cultures in microfluidic devices. This approach allowed us to perform live-imaging and quantification of the effects of ICI on the tumor ecosystem.The design of the chip consists of three parallel micro-chambers, separated by micro-pillars that allow the confinement of a biomimetic hydrogel in the central channel by capillarity. By co-culturing autologous NSCLC cells and cytotoxic T lymphocytes (harvested from the TILs of the same patient and furtherly amplified in vitro) we could recapitulate, visualize and quantify an efficient and specific cytotoxic activity of the T cells against the autologous cancer cells. For this purpose, we developed a novel algorithm that could localize the cancer cells and, thanks to a fluorescent reporter of the caspase activity, measure their death in a time- and space-specific manner. In these 3D co-cultures the cytotoxic activity of T cells was enhanced by the treatment with PD-1 inhibitor and PD-L1 inhibitor, therefore reconstituting on-chip an ICI response. Furthermore, this method allowed us to extract a parameter, the potential of death induction, which mathematically estimates the “contagiousness of death” by computing the proximity in space and time of death signals. Interestingly, this analysis revealed us that the death of cancer cells caused by either chemotherapy or cytotoxic T cells is contagious, whereas in control conditions the cancer cells death is stochastic. This observation may have biological and clinical implications, for instance regarding the bystander effect, observed after radiotherapy treatment. Furthermore, in order to have a molecular insight on the impact of the co-culture on T cells, in presence or absence of ICI, we analyzed by flow cytometry the expression of several T cell markers. After 3 days of co-culture on chip, the T cells showed an increased expression of activation markers, such as CD69 and CD25, as well as an increased expression of exhaustion markers, notably PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, CD137 and OX-40. The coupling of image analysis and the study of T cell plasticity, allowed us to associate for the first time the finely quantified cytotoxic activity of the T cells and their activation/exhaustion status and describe a responsive phenotype to immunotherapies. In this thesis, we demonstrated that the tumor-on-chip is suitable to evaluate the efficacy of immune checkpoint inhibitors, to potentially assess the effect of combined drugs and to study the mechanisms of cancer cell primary resistance.