Caractérisation structurale de TDP-43, une protéine de liaison à l’ARN, impliquée dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)

Structural characterization of TDP-43, an RNA-binding protein involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)

• Auteur / Autrice : Juan Rengifo Gonzalez
• Direction : Ahmed Bouhss
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 02/07/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Structure et activité des biomolécules normales et pathologiques (Evry, Essonne ; 2007-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....)
• Jury : Président / Présidente : David Pastre
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Luc Dupuis, Séverine Boillée, Alena Shkumatava, Marie-Jeanne Clément-Lai Chéong
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Luc Dupuis, Séverine Boillée, Alena Shkumatava

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sclérose latérale amyotrophique

ARN viral

Protéines de liaison à l'ARN

Mots clés libres

Tdp-43

Neurodégénérescence

Agrégation

Sla

Tdp-43

Neurodegeneration

Aggregation

Als

Résumé

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ou Maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative fatale et sans remède avec une prévalence de 2,5 à 3 cas par 100 000 habitants. Ce travail de thèse est consacré à TDP-43, une protéine de liaison à l'ARN, impliquée dans cette maladie et retrouvée dans des inclusions cytoplasmiques des neurones et motoneurones de malades SLA. Cette protéine cible principalement des longues séquences d'ARN riches en répétitions GU. En conditions normales, TDP-43 est localisée majoritairement dans le noyau. Elle est impliquée dans des processus d'épissage de l'ARN messager ainsi que dans la maturation et transport des ARNs. TDP-43 est impliquée dans la plasticité neuronale et dans la formation de compartiments appelés « phases liquides » par l'intermédiaire de granules de stress. Auparavant, il a été démontré que le domaine N-terminal (NTD) ainsi que le domaine C-terminal (CTD) intrinsèquement désordonné de TDP-43 sont impliqués dans des autoassemblages constitués de complexes de haut poids-moléculaire. Au cours de ce processus, le rôle des domaines RRMs responsables de la fixation de l'ARN reste à déterminer. Ainsi, le mécanisme déchiffrant le rôle de la fixation de cette protéine à l'ARN, dans son maintien à l'état normal ou pathologique, reste à élucider.Par une approche intégrative, nous avons entrepris une étude approfondie de la fixation de TDP-43 sur de longues séquences poly-GU, trouvées dans des régions introniques de certains pré-ARNm cibles de TDP-43. Nous avons montré que TDP-43 se fixe sur ces cibles poly-GU de manière coopérative en formant des multimères. Un modèle structural 3D a été obtenu lequel met en évidence une interface d'interaction entre deux unités monomériques de TDP-43 qui favorise la multimérisation. Cette interface intermoléculaire implique une poche centrée autour du résidu Val220, localisé dans le domaine RRM2 du premier monomère et la boucle 3 du domaine RRM1 de la seconde unité monomérique. Les résidus d'acides aminés et les interactions mises en jeu, pour la stabilité de cette interface, ont été identifiés. Par la suite, nous avons étudié in cellulo des formes mutées de TDP-43 dont la coopérativité est altérée. Ainsi, nous avons montré que la coopérativité de liaison de TDP-43 à l'ARNm est déterminante pour la solubilité de cette protéine aussi bien que pour la miscibilité de ses condensats dans les granules du stress au niveau du cytoplasme. Enfin, un modèle mécanistique a été proposé selon lequel des assemblages de TDP-43 mettant en jeu ses domaines RRM liés sur l'ARN, limitent des auto-interactions entre les domaines NTD et CTD des unités monomériques adjacentes. Ces assemblages favoriseraient ainsi la dynamique et la solubilité des complexes TDP-43/ARN. Une altération de la coopérativité d'interaction de ce complexe pourrait faciliter une fixation désordonnée de TDP-43 le long des ARNs ce qui favoriserait une abondance des interactions entre les domaines NTD et CTD et ainsi promouvoir l'agrégation de TDP-43. En conclusion, la multimérisation de TDP-43 opérée sur la plateforme ARN cible jouerait ainsi un rôle crucial dans le contrôle de son agrégation et dans certains processus d'épissage des ARN messagers.

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease without any cure. The prevalence of ALS accounts for 2.5 to 3 cases per 100.000 inhabitants. This thesis work is devoted to TDP-43, an RNA-binding protein involved in ALS and found in cytoplasmic inclusions of neurons and motor neurons from ALS patients. The targets of TDP-43 are primarily GU-rich RNA sequences. In physiological conditions, TDP-43 localizes predominantly in the nucleus. The functions of this protein are associated to the splicing of messenger RNAs as well as the maturation and transport of RNAs. TDP-43 is also involved in the neuronal plasticity and in the formation of membrane-less compartments called “liquid-liquid phases” through the formation of stress granules (SGs). While the high-order TDP-43 self-assembly by its structured N-terminal (NTD) and the intrinsically disordered C-terminal domains (CTD) has been extensively studied, the role of the RRM domains responsible for the RNA binding remains unaddressed. Therefore, the mechanism dissecting the role of high-order TDP-43/RNA complexes in maintaining TDP-43 functional, in normal and pathological conditions, needs to be investigated.Through an integrative approach, we undertook an in-deep study regarding the TDP-43 binding on long poly-GU sequences which are found in the intronic regions of many TDP-43 target pre-mRNAs. We have shown that TDP-43 binds on poly-GU targets in a cooperative manner by self-assembling into multimers. A 3D structural model has been also obtained which highlights an interaction interface between deux monomeric TDP-43 units leading to the protein multimerization. This intermolecular interface involves a pocket centered around the V220 residue, located in the RRM2 domain of the first TDP-43 monomer and the loop 3 of RRM1 of the second monomer. The amino acid residues and the intermolecular interactions essential for the interface stability have been identified. Additionally, we have investigated, by in cellulo methods, several mutant forms of TDP-43 in which the cooperativity is impaired. Thus, we demonstrate that the cooperative binding of TDP-43 on mRNAs is critical to maintain the solubility of nuclear TDP-43 and the miscibility of TDP-43 condensates within cytoplasmic SGs. Based on the results presented here, we propose a mechanistic model in which the high-order TDP-43 assemblies promoted by the RRM domains bound to the RNA, constitutes a steric barrier limiting short range self-interactions between consecutive NTDs and CTDs of adjacent monomeric TDP-43 units. These assemblies may therefore favorize the dynamics and solubility of TDP-43/mRNA complexes. Impairments in the cooperative interaction of these complexes may lead to an anarchic attachment of TDP-43 along mRNAs leading to an increased occurrence of self-attraction between the NTDs and CTDs. Impaired multimers may then promote the TDP-43 aggregation. In conclusion, the TDP-43 multimerization on target RNA platforms would play a crucial role in processes linked to the control of its aggregation and mRNA splicing.