Role of an endogenous suppressor of RNAi in plant development and plant-pathogen interactions
Rôle d’un suppresseur endogène de RNAi dans le développement de la plante et ses interactions avec les pathogènes
Résumé
Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) is a defense mechanism that targets invading nucleic acids of endogenous (transposons) or exogenous (pathogens, transgenes) origins. During virus infection, PTGS theoretically targets double-stranded (ds)RNA intermediates of viral replication and viral single-stranded RNAs; however, most viruses encode proteins, referred to as viral suppressor of RNAi (VSR), which inhibit PTGS. In the model plant Arabidopsis thaliana, an enzyme referred to as RNase THREE-LIKE 1 (RTL1) is induced in response to viral infection and cleaves dsRNAs in a non-specific manner. This enzyme should provide a second line of defense by cleaving viral dsRNAs, but VSR that inhibit PTGS generally inhibit RTL1, indicating that viruses had put in place tools that simultaneously counteract these two defense mechanisms. Nevertheless, at least one virus, Turnip yellow mosaic virus (TYMV), is not able to inhibit RTL1 and in fact seems to take advantage of RTL1 to successfully infect A. thaliana (Shamandi et al., 2015).In this thesis, we deepened the study of Arabidopsis-TYMV interaction. We show that TYMV is not able to inhibit PTGS execution but is able to inhibit PTGS amplification. This effect is due to the viral protein P69, and we show that P69 localizes in cytoplasmic foci called siRNA-bodies, where PTGS amplification takes place. Furthermore, using in house-generated rtl1 mutants, we show that the lack of RTL1 delays TYMV infection and promotes the production of siRNAs directed against the virus, whereas RTL1 overexpression enhances viral symptoms and suppresses the production of anti-viral siRNAs. We show that RTL1 is found in siRNA-bodies, and we show that RTL1 attacks not only dsRNAs but also siRNAs. These results indicate that, TYMV successfully infect A. thaliana by : i) replicating in chloroplast membrane invaginations (Prod’homme et al., 2003), which likely shelter dsRNAs intermediates of replication from PTGS and RTL1, ii) inducing RTL1 expression, which promotes the destruction of dsRNAs and siRNAs produced by PTGS in siRNA-bodies in response to TYMV infection, and iii) expressing the P69 protein to inhibit residual PTGS amplification.Despite a neutral or detrimental effect on plant anti-viral PTGS, RTL1 is conserved in all Arabidopsis accessions, and the study of synonymous and non-synonymous substitutions ratios in RTL1 genes from 42 dicotyledonous plant reveals that RTL1 is under the control of a conservative selection, suggesting an essential role. In A. thaliana, RTL1 is weakly expressed in roots, in senescent tissues and during seed development. Phenotyping wild-type plants and rtl1 mutants did not revealed any significant morphological differences, but we observed that seeds weight is enhanced in rtl1 mutants. Moreover, we observed an increased senescence in rtl1 mutants, in particular in the Ler accession. This difference between Ler and Col prompted us to determine if RTL1 could participate in the natural variability of transgene PTGS efficiency between Ler (weak PTGS) and Col (strong PTGS). We observed that rtl1 mutations have no significant effect on PTGS efficiency in Col, but enhances PTGS efficiency in Ler, up to the level of Col, which could be explained by a strongest RTL1 expression in Ler compared to Col. These results indicate that the effect of RTL1 impairment should be further examined in normal and infectious contexts by focusing on Ler rather than Col.
Le Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) est un mécanisme dirigé contre les acides nucléiques invasifs endogènes (transposons) et exogènes (pathogènes, transgènes). Dans le cas des virus, le PTGS peut s’attaquer aux ARNs double-brin (dsRNAs) intermédiaires de la réplication virale et aux ARNs simple-brin viraux, mais il est souvent inhibé par des protéines virales appelées Viral Suppressor of RNAi (VSR). Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, une enzyme appelée RNase THREE-LIKE 1 (RTL1) est induite en réponse à l'infection virale et détruit les dsRNAs de manière non sélective. Cette enzyme devrait assurer à la plante une seconde ligne de défense en clivant les dsRNAs viraux, mais les VSR qui inhibent le PTGS inhibent généralement RTL1, indiquant que les virus ont mis en place des outils capables de combattre simultanément ces deux mécanismes de défense. Toutefois, un virus, le Turnip yellow mosaic virus (TYMV), est incapable d’inhiber RTL1 et semble même tirer profit de RTL1 pour réussir à infecter A. thaliana (Shamandi et al., 2015).Au cours de cette thèse, nous avons approfondi l’étude de l’interaction Arabidopsis-TYMV. Nous avons montré que le TYMV est incapable d’inhiber l’exécution du PTGS, mais est toutefois capable d’inhiber l’étape d’amplification du PTGS. Cette action est due à la protéine virale P69, et nous avons montré que P69 est retrouvée dans des corpuscules cytoplasmiques appelés siRNA-bodies qui sont le siège de l’amplification du PTGS. Par ailleurs, nous avons généré des mutants rtl1 et montré que l’absence de RTL1 retarde l’infection par le TYMV et augmente la quantité de siRNAs dirigés contre le virus, tandis que la surexpression de RTL1 favorise l’infection et inhibe la production des siRNAs anti-viraux. Nous avons observé que RTL1 était retrouvée dans les siRNA-bodies, et nous avons montré que RTL1 était capable de détruire non seulement les dsRNAs mais également les siRNAs. Ces résultats indiquent donc que le TYMV réussit à infecter A. thaliana en : i) se répliquant dans des invaginations de la membrane chloroplastique (Prod’homme et al., 2003) qui mettent vraisemblablement les dsRNAs intermédiaires de la réplication à l’abri du PTGS et de RTL1, ii) en induisant l’expression de RTL1 qui s’attaque aux dsRNAs et siRNAs induits par le PTGS dans les siRNA-bodies en réponse à l’infection, et iii) en exprimant la protéine P69 qui complète l’action de RTL1 en inhibant l’amplification du PTGS résiduel.Malgré un effet neutre ou négatif pour la plante vis-à-vis des virus, RTL1 est conservé dans toutes les accessions d’Arabidopsis, et l’étude du ratio des mutations synonymes et non synonymes dans les gènes RTL1 de 42 Eucotylédones suggère que RTL1 subit une pression de sélection de conservation, suggérant un rôle essentiel. Chez A. thaliana, RTL1 est exprimé faiblement dans la racine, les tissus en sénescence, et au cours du développement de la graine. Le phénotypage des plantes sauvages et des mutants rtl1 n’a pas révélé de différences morphologiques notables, mais nous avons observé que le poids des graines était supérieur chez les mutants rtl1. Par ailleurs, nous avons observé une senescence accrue chez le mutant rtl1, en particulier dans l’accession Ler. Cette différence entre Ler et Col nous a poussé à examiner si RTL1 pouvait contribuer à la variabilité naturelle du PTGS des transgènes entre les accessions Ler (PTGS peu efficace) et Col (PTGS très efficace). Nous avons observé que la mutation rtl1 n’affectait pas sensiblement l’efficacité du PTGS chez Col mais augmentait celle de Ler au niveau de Col, ce qui pourrait s’expliquer par une plus forte expression de RTL1 chez Ler que chez Col. L’effet de l’absence de RTL1 devra donc être précisé en condition normale et en condition d’infection en privilégiant Ler plutôt que Col.
Origine : Version validée par le jury (STAR)