Characterization of the histone methyltransferase Ezl1 of Paramecium tetraurelia and identification of its protein partners

par Caridad Miro Pina

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Sandra Duharcourt.

Soutenue le 23-09-2020

à l'Université de Paris (2019-....) , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Institut Jacques Monod (Paris) (laboratoire) .

Le président du jury était Jonathan Weitzman.

Le jury était composé de Sandra Duharcourt, Jonathan Weitzman, Clément Carré, Francesca Palladino, Angélique Deleris.

Les rapporteurs étaient Clément Carré, Francesca Palladino.

  • Titre traduit

    Caractérisation de l’histone méthyltransférase Ezl1 de Paramecium tetraurelia et identification de ses partenaires protéiques


  • Résumé

    Dans les génomes eucaryotes, la structure de la chromatine définit et maintient des états transcriptionnels actifs ou silencieux. Les modifications post-traductionnelles des histones ont un rôle essentiel pour définir son état transcriptionnel. La méthylation de la lysine 9 et la méthylation de la lysine 27 sur l'histone H3 sont deux modifications associées à des régions génomiques silencieuses. Ces deux marques d'histones silencieuses sont déposées par des machineries différentes et sont associées à des régions distinctes du génome. H3K9me3 est catalysée par les enzymes SU(VAR)3-9 et est présente principalement au niveau des séquences répétées d'ADN, comme les éléments transposables et les séquences satellites. H3K27me3 est déposé par les enzymes Enhancer-of-zeste, sous-unités catalytiques du Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), et est impliqué dans la répression transcriptionelle des gènes. Au laboratoire, nous utilisons le modèle unicellulaire Paramecium tetraurelia pour comprendre comment les modifications des histones sont ciblées sur des régions spécifiques du génome. Chez Paramecium, deux noyaux distincts coexistent dans le même cytoplasme. Le micronoyau (MIC) contient le génome de la lignée germinale qui est transmis à la progéniture sexuelle, tandis qu'un macronoyau somatique (MAC) contient un génome réduit et optimisé pour l'expression des gènes. Après les événements sexuels, un nouveau MAC se différencie à partir du noyau zygotique. Au cours du développement du MAC, des réarrangements du génome conduisent à l’élimination des éléments transposables (TE) présents dans la lignée germinale. Comment un si grand nombre de séquences différentes sont spécifiquement reconnues et éliminées reste à élucider. Des travaux antérieurs ont montré que Enhancer-of-zeste like 1 (Ezl1), l'homologue chez Paramecium de la sous-unité lysine méthyltransférase de PRC2, est requis pour l’élimination d’ADN. Mon travail a permis de montrer que Ezl1 catalyse la méthylation de l'histone H3 in vitro et in vivo avec une spécificité apparente envers K9 et K27. Nous constatons que H3K9me3 et H3K27me3 coexistent sur les copies d'éléments transposables de manière dépendante d'Ezl1. Nous démontrons que la perte de ces marques d'histones entraîne une hyperactivation transcriptionnelle globale des éléments transposables et a des effets modestes sur l'expression des gènes codant pour des protéines. Nous montrons en outre que la voie scanRNA/ARNi est nécessaire pour la répression transcriptionnelle des éléments transposables et pour le dépôt de H3K9me3 et H3K27me3 sur ces sites chromatiniens. La purification de Ezl1 par affinité en tandem combinée à la spectrométrie de masse m’a permis d'identifier les protéines qui interagissent physiquement, de façon directe ou indirecte, avec cette protéine et qui, probablement, forment le complexe Paramecium Ezl1-Polycomb. L’inactivation des gènes correspondants indique que la plupart des protéines identifiées sont nécessaires pour la déposition de H3K9me3 et H3K27me3. Par conséquent, notre étude suggère que, chez Paramecium, un complexe Polycomb avec une double spécificité de substrat H3K9 et H3K27 est recruté au niveau des éléments transposables, un mécanisme qui a été décrit pour le recrutement des enzymes SU(VAR)3-9.


  • Résumé

    In eukaryotic genomes, chromatin structure defines and maintains active and silent transcriptional states. Histone post-translational modifications can alter chromatin structure and thus, have an essential role in dictating its transcriptional state. Methylation of lysine 9 and lysine 27 of histone H3 are associated with silenced genomic regions. These two silent histone marks are deposited by different machineries and play distinct roles. H3K9me3 is catalysed by the SU(VAR)3–9 enzymes and is present mainly at repeated DNA sequences, such as transposable elements and satellites. H3K27me3 is deposited by the Enhancer-of-zeste enzymes, acting as the catalytic subunits of Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) and is involved in gene repression. Here, we use the unicellular model Paramecium tetraurelia to unravel how histone modifications are targeted to specific regions of the genome. In Paramecium, two distinct nuclei coexist in the same cytoplasm. The micronucleus (MIC) contains the germline genome that is transmitted to sexual progeny, while a somatic macronucleus (MAC) contains a reduced genome streamlined for gene expression. After fertilization, a new MAC differentiates from a copy of the zygotic nucleus. During MAC development, genome-wide rearrangements remove virtually all transposable elements (TEs) in the germline. How such a large number of different germline sequences are specifically recognized and eliminated remains an intriguing question. Previous work showed that Enhancer-of-zeste like 1 (Ezl1), the Paramecium homolog of the lysine methyltransferase component of PRC2, is required for programmed DNA elimination. My work allowed to show that Ezl1 catalyzes methylation of histone H3 in vitro and in vivo with an apparent specificity toward both K9 and K27. We find that H3K9me3 and H3K27me3 co-occur at multiple families of transposable elements in an Ezl1-dependent manner. We demonstrate that loss of these histone marks results in global transcriptional hyperactivation of transposable elements with modest effects on protein-coding gene expression. We further show that the scnRNA/RNAi pathway is required for the transcriptional repression of transposable elements and for the deposition of H3K9me3 and H3K27me3 at these chromatin sites. Tandem affinity purification of Ezl1 combined with mass spectrometry allowed me to identify the proteins that physically interact with it, directly or indirectly, and likely form the Paramecium Ezl1-Polycomb complex. Knockdown of the corresponding genes indicates that most of the identified proteins are required for deposition of H3K9me3 and H3K27me3. Therefore, our study suggests that, in Paramecium, a Polycomb complex with H3K9 and H3K27 dual substrate specificity is recruited to transposable elements, a mechanism that has been described for the recruitment of SU(VAR)3–9 enzymes.



Le texte intégral de cette thèse sera accessible librement à partir du 23-09-2023

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