Rôles des transporteurs de métabolites nucléotidiques dans l’érythropoïèse et dans le globule rouge mature

Role of nucleotide metabolite transporters in erythropoiesis and red blood cell functions

• Auteur / Autrice : Mahmoud Mikdar
• Direction : Thierry Peyrard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Physiologie et physiopathologie
• Date : Soutenance le 17/09/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie intégrée du globule rouge (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Hermine
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thierry Peyrard, Olivier Hermine, Lionel Blanc, Loïc Garçon, Slim Azouzi, Naomi Taylor
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Lionel Blanc, Loïc Garçon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Adénosine

Nucléotides cycliques

Cellules souches hématopoïétiques

Érythrocytes

Érythropoïèse

Mots clés libres

Antigènes de groupes sanguins

Blood group antigens

Résumé

De récents travaux ont montré que les voies métaboliques sont fortement impliquées dans la régulation de l’engagement et la différentiation des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) vers les différentes lignées hématopoïétiques. Les nucléosides sont des métabolites et précurseurs indispensables pour la biosynthèse des nucléotides, et dont la disponibilité intracellulaire dépend de leur transport à travers la membrane plasmique. Cependant, le rôle des transporteurs de nucléosides et de nucléotides dans l’engagement érythroïde des CSHs reste mal défini. Au cours de ma thèse, l’analyse fonctionnelle des cellules sanguines de patients déficitaires de ENT1 ou ABCC4 a démontré pour la première fois que le transport des nucléosides (ENT1) et nucléotides (ABCC4) est essentiel pour maintenir (i) le métabolisme des nucléotides cycliques et désoxynucléotide, (ii) une morphologie et une déformabilité normales des globules rouges, (iii) la phosphorylation des protéines de la membrane érythrocytaire ainsi que l’organisation du cytosquelette, (iv) la physiologie plaquettaire et (v) l’érythropoïèse ex vivo. De plus, nos expériences mécanistiques ont démontré que ENT1 joue un rôle crucial dans l’engagement des CSHs vers la lignée érythroïde en contrôlant le métabolisme des nucléotides cycliques et l’activation des facteurs de transcriptions érythroïdes. Ce travail a également montré qu’une mutation compensatoire dans le gène ABCC4, retrouvée chez deux patients ENT1null, diminuait les altérations érythroïdes chez ces patients, ce qui confirme le rôle de ces deux transporteurs dans la régulation intracellulaire de l’AMP cyclique. De plus, ce résultat a été confirmé par un modèle souris Ent1-/- puisque le traitement de ces souris avec un inhibiteur de ABCC4 augmente l’engagement érythroïde des CSHs, l’érythropoïèse et l’hématocrite. En outre, une étude protéomique et génomique sur des sujets PEL-négatif a montré qu’une large délétion dans le gène ABCC4 est responsable de ce groupe sanguin. L’inactivation du gène ABCC4 dans une lignée cellulaire par CRISPR-Cas9 a confirmé que l’antigène de groupe sanguin PEL est portée par la protéine ABCC4. Contrairement à ENT1, l’absence totale de ABCC4 est associée à une altération de la fonction plaquettaire sans anomalie de la lignée érythroïde et dont le mécanisme de compensation n’implique pas ENT1. En conclusion, mon travail de thèse dévoile un nouveau mécanisme moléculaire régulant l’érythropoïèse, et démontre le rôle important du métabolisme des nucléotides dans l’engagement des CSHs et dans la biologie érythroïde. Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’anémie basées sur la disponibilité intracellulaire des nucléosides et des nucléotides.

Recently, metabolic pathways have emerged as critical components in the regulation of hematopoietic stem cell (HSC) renewal, as well as in lineage commitment and differentiation. Nucleosides are major metabolite precursors for nucleotide biosynthesis and their availability in HSCs is dependent on their transport through specific membrane transporters. However, the role of nucleoside and nucleotide transporters in the differentiation of HSCs to the erythroid lineage remains undefined. In the present work, we demonstrate for the first time that nucleoside (ENT1) and nucleotide (ABCC4) transport is essential for the (i) metabolism of cyclic nucleotides and deoxynucleotides (ii) erythrocyte morphology and deformability, (iii) erythrocyte membrane protein phosphorylation and skeleton organization, (iv) platelet function, and (v) ex vivo erythropoiesis. Interestingly, functional and mechanistic experiments showed that the equilibrative nucleoside transporter 1 (ENT1) controls the nucleotide metabolism and the activation of erythroid transcription factors. This finding explains the role of ENT1 in maintaining the optimal erythroid commitment and differentiation of HSCs. On the other hand, although the downregulation of the ABC nucleotide transporter ABCC4 attenuates the erythroid disorders in ENT1null patients, its total loss results in abnormal platelet function without erythroid disorders. Importantly, we demonstrate that a large deletion in ABCC4 gene is associated with the PEL-negative null blood phenotype. The loss of PEL expression on ABCC4-CRISPR-Cas9 K562 cells and its overexpression in ABCC4-transfected cells provided evidence that ABCC4 is the gene underlying the PEL blood group antigen. Targeting ENT1 and ABCC4 transporters either by knockout or pharmacological inhibition in mice lead to a marked change in blood cells counts. Specifically, the genetic deletion of Ent1 in mice results in a decreased RBC production and macrocytosis. While mice treated with ABCC4 inhibitor increased the erythroid commitment of HSCs, and enhanced erythropoiesis as demonstrated by the increase of circulating erythrocytes and reticulocytes. Overall, our findings reveal a new molecular mechanism regulating erythropoiesis and highlight the important role of nucleotide metabolism in the lineage commitment of HSCs and erythroid biology. Our findings open new avenues for the development of novel therapeutic strategies for the treatment of anemia.