L’impact de JAK2V617F sur la différenciation érythroïdes terminale et l'électrophysiologie des globules rouges dans la Polyglobulie de Vaquez

Impact of JAK2V617F on Terminal Erythroid Differentiation and Red Blood Cell Electrophysiology in Polycythemia Vera

• Auteur / Autrice : Ralfs Buks
• Direction : Wassim El Nemer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Physiologie et physiopathologie
• Date : Soutenance le 10/06/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie intégrée du globule rouge (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Bruno Cassinat
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Wassim El Nemer, Bruno Cassinat, François Delhommeau, Lars Kaestner, Isabelle Plo, Stéphane Egée
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : François Delhommeau, Lars Kaestner

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biogenèse des organelles

Membrane érythrocytaire

Kinase Janus-2

BCRP (protéine)

Ruxolitinib

Érythrocytes

Polyglobulie primitive

Mots clés libres

Canal Gárdos

JAK2V617F

Résumé

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) regroupent des pathologies caractérisées par une prolifération et une différenciation anormales des cellules souches hématopoïétiques. La polyglobulie de Vaquez (PV) est un type de NMP caractérisé par un nombre de globules rouges (GR) élevé. Plus de 95% des patients atteints de PV présentent la mutation V617F de la tyrosine kinase JAK2 conduisant à une prolifération érythroïde incontrôlée entraînant un risque élevé de thrombose. Les patients présentant un risque pronostique élevé sont traités par des thérapies cytoréductrices, dont le ruxolitinib, un inhibiteur de JAK1/JAK2. Nous avons analysé le protéome de la membrane des GR PV par spectrométrie de masse et avons montré des niveaux élevés de protéines de liaison au Ca2+ ainsi que la présence anormale de protéines du réticulum endoplasmique.Dans cette thèse, nous avons étudié (1) l'impact de JAK2V617F sur l'expression et le tri des protéines pendant la différenciation érythroïde terminale, l'énucléation et la maturation ; (2) l'impact de JAK2V617F sur l'homéostasie du calcium et l'électrophysiologie des GR dans la PV ; (3) l'import du ruxolitinib dans le compartiment intracellulaire. Nos données montrent que JAK2V617F jouerait un rôle dans la rétention des organelles pendant la phase d'énucléation des érythroblastes, ce qui pourrait perturber la maturation des réticulocytes circulants chez la souris et l'homme. Nos données obtenues par patch-clamp automatisé montrent une homéostasie calcique modifiée dans les GR PV et des lignées cellulaires exprimant JAK2V617F, avec un impact fonctionnel sur l'activité du canal Gárdos, ce qui pourrait contribuer à une déshydratation cellulaire dans un contexte JAK2V617F. Enfin, nous avons étudié le transport du ruxolitinib à l’aide de tests de cytotoxicité et d'apoptose dans des lignées cellulaires humaines, des GR et des progéniteurs érythroïdes humains différenciés in vitro. Nos résultats suggèrent que le ruxolitinib est importé dans le compartiment intracellulaire par la protéine ABCG2, un membre de la superfamille des transporteurs à « ATP binding cassette » (ABC).Étant donné le rôle central du calcium dans la régulation des voies de signalisation, notre étude ouvre de nouvelles perspectives pour explorer la relation entre JAK2V617F, l'homéostasie du calcium et les anomalies cellulaires dans les NMP telles que les interactions cellulaires dans la circulation sanguine en relation avec les événements thrombotiques. Ces interactions pourraient également être déclenchées par les propriétés anormales des GR suite à des défauts de maturation réticulocytaire. En ce qui concerne le traitement des patients, notre étude montre pour la première fois le rôle d'un transporteur spécifique dans l’import intracellulaire du ruxolitinib. Elle ouvre de nouvelles perspectives de recherche sur l'efficacité du ruxolitinib en analysant le polymorphisme d'ABCG2 et son expression sur les cellules cibles des patients traités.

Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are a group of disorders characterised by abnormal proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells in the bone marrow. Polycythemia Vera (PV) is a type of MPN characterised by overproduction of red blood cells (RBCs). Over 95 % of PV patients carry the V617F mutation in the tyrosine kinase Janus kinase 2 (JAK2) resulting in uncontrolled erythroid proliferation and high risk of thrombosis. Patients with high prognostic risk scores are treated with cytoreductive therapies, including ruxolitinib, a JAK1/JAK2 inhibitor. Using mass spectrometry, we analysed the RBC membrane proteome and showed elevated levels of multiple Ca2+ binding proteins as well as endoplasmic reticulum residing proteins in PV RBC membranes compared to RBC membranes from healthy individuals. In this thesis we investigated:(1) the impact of JAK2V617F on protein expression and sorting during terminal erythroid differentiation, enucleation and maturation;(2) the impact of JAK2V617F on calcium homeostasis and RBC electrophysiology in PV;(3) ruxolitinib import in the intracellular compartment.Our data shows that JAK2V617F could play a role in organelle retention during the enucleation step of erythroid differentiation, which may affect maturation of circulating reticulocytes in mouse and human. Our data from automated patch-clamp shows modified calcium homeostasis in PV RBCs and cell lines expressing JAK2V617F, with a functional impact on the activity of the Gárdos channel that could contribute to cellular dehydration. Finally, we investigated ruxolitinib transport using cytotoxicity and apoptosis assays in human cell lines, RBCs and in vitro differentiated human erythroid progenitors. Our findings suggest that ruxolitinib is imported in the intracellular compartment by ABCG2, a member of the ATP-binding cassette (ABC) transmembrane superfamily.Given the central role that calcium plays in the regulation of signalling pathways, our study opens new perspectives to explore the relationship between JAK2V617F, calcium homeostasis and cellular abnormalities in MPNs, including cellular interactions in the bloodstream in relation to thrombotic events. These interactions could also be triggered by the abnormal properties of circulating RBCs secondary to the presence of organelle remnants in their membrane and cytoplasm. Regarding patients’ treatment, our study shows for the first time the role of a specific transporter in ruxolitinib cellular influx. It opens new perspectives in ruxolitinib efficacy research targeting cell types depending on ABCG2 expression and polymorphisms among patients.