Impact des antibiotiques sur le phageome intestinal humain : de la méthode à l’application

Impact of antibiotics on the human gut phageome : from method to application

• Auteur / Autrice : Camille d' Humières
• Direction : Erick Denamur, Eduardo Pimentel Cachapuz Rocha
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences. Génétique
• Date : Soutenance le 24/01/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Infection, anti-microbien, modélisation, évolution (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Stéphane Bonacorsi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Erick Denamur, Eduardo Pimentel Cachapuz Rocha, Stéphane Bonacorsi, Marie-Cécile Ploy, Mireille Ansaldi, David Vallenet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Cécile Ploy, Mireille Ansaldi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactériophages

Microbiome gastro-intestinal

Résistance aux antibiotiques

Gènes

Antibiotiques

Flore intestinale

Mots clés libres

Microbiote intestinal

Phages

Phageome intestinal

Intestinal microbiota

Phages

Intestinal phageome

Résumé

L’antibiorésistance est un problème majeur de santé publique. Mieux comprendre l’impact des antibiotiques sur le microbiote intestinal et l’acquisition de résistances est essentiel. Dans le cadre d’une étude clinique randomisée contrôlée (CEREMI), deux antibiotiques (ceftriaxone et céfotaxime) aux spectres d’activité antimicrobienne similaire, mais aux modes d’élimination différents, ont été administrés à 22 volontaires sains. Les selles de ces derniers ont été collectées à différents temps sur une période de 6 mois, afin d’évaluer l’impact des antibiotiques sur la composition et l’évolution des communautés bactériennes et phagiques (virus bactériens) du microbiote intestinal ainsi que la présence de gènes de résistance aux antibiotiques.L’étude du phageome intestinal a nécessité le développement de méthodologies adaptées tant au niveau expérimental que bioinformatique. Suite à la comparaison de différentes méthodes d’isolement de phages issus de fèces, la technique de concentration au polyéthylène glycol s’est révélée être la plus adaptée à notre étude au regard du grand nombre d’échantillons (>100) à analyser par la suite, de par sa simplicité, sa reproductibilité, son faible coût et de la grande diversité des phages obtenus. Un pipeline bioinformatique d’identification et d’annotation des phages, combinant des approches de métagénomique et de génomique comparative, a été spécifiquement développé. Il permet, à partir des reads issus du séquençage métagénomique des phages, d’assembler, d’annoter syntaxiquement et fonctionnellement les différents contigs, et enfin de prédire automatiquement s’ils sont des phages. Ces méthodologies ont ainsi été appliquées à l’ensemble des échantillons de selles issues de l’étude CEREMI.Les analyses de la communauté phagique ont révélé que l’usage de ces deux antibiotiques entraine une forte perturbation du phageome intestinal avec un retour progressif à l’équilibre au 30ème jour. L’usage de ceftriaxone semble cependant avoir un effet plus important sur la baisse de diversité phagique. Malgré cette perturbation le phageome intestinal reste hautement individu-spécifique et ne semble pas impliqué dans le transfert de gènes de résistance aux antibiotiques.En parallèle, l’étude de la communauté bactérienne, par des comptages bactériens et l’analyse des 16S, a montré que les deux antibiotiques entrainent une diminution rapide et drastique de la diversité bactérienne, sans pour autant sélectionner de bacilles à Gram négatifs résistants aux céphalosporines de troisième génération. Contrairement au phageome, les deux traitements semblent avoir un impact similaire sur le bactériome.

Antimicrobial resistance is a major public health problem. A better understanding of the impact of antibiotics on the intestinal microbiota and the development of resistance is essential. In a randomized controlled clinical trial (CEREMI), two antibiotics (ceftriaxone and cefotaxime) with similar antimicrobial activity spectrum, but different modes of elimination, were administered to 22 healthy volunteers. The stools of the latter were collected at different times over a period of 6 months, in order to evaluate the impact of antibiotics on the composition and evolution of bacterial and phage (bacterial viruses) communities of the intestinal microbiota as well as on the presence of antimicrobial resistance genes.The study of the intestinal phageome required the development of methodologies adapted to both experimental and bioinformatics levels. Following the comparison of different methods of isolating phages from feces, the polyethylene glycol concentration technique proved to be the most suitable for our study given the large number of samples (>100) to be analysed later, its simplicity, reproducibility, low cost and the great diversity of the phages obtained. A bioinformatics pipeline for phage identification and annotation, combining metagenomic and comparative genomic approaches, has been specifically developed. It allows, from the reads resulting from the metagenomic sequencing of phages, to assemble, annotate syntactically and functionally the different contigs, and finally to automatically predict if they are phages. These methodologies were thus applied to all stool samples from the CEREMI study.The analyses of the phage community revealed that the use of these two antibiotics causes a strong disturbance of the intestinal phageome with a gradual return to equilibrium on the 30th day. However, the use of ceftriaxone seems to have a greater effect on the decrease in phage diversity. Despite this disruption, the intestinal phageome remains highly individual-specific and does not appear to be involved in the transfer of antibiotic resistance genes.In parallel, the study of the bacterial community, through bacterial counts and 16S analysis, showed that both antibiotics lead to a rapid and drastic decrease in bacterial diversity, without selecting Gram-negative bacilli resistant to third generation cephalosporins. Unlike the phageome, both treatments seem to have a similar impact on the bacteriome.