Characterisation of intracardiac extracellular vesicles in the context of myocardial infarction and type II diabetes

Caractérisation des vésicules extracellulaires intracardiaques dans le contexte de l'infarctus du myocarde et du diabète de Type II

• Auteur / Autrice : Muhammad Bin Mazlan
• Direction : Xavier Loyer, Chantal M. Boulanger
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie et physiopathologie
• Date : Soutenance le 11/12/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Paris Centre de Recherche Cardiovasculaire (Paris ; 2010-....)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Menasché
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Menasché, Soazig Le Lay, Aurélie Leroyer, Dominique P. V. de Kleijn
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Soazig Le Lay, Aurélie Leroyer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vésicules extracellulaires

Diabète non-insulinodépendant

Infarctus du myocarde

Mots clés libres

Infarctus du myocarde

Diabète type II

Vésicules extracellulaires

Extracellular vesicles

Myocardial infarction

Type II diabetes

Résumé

Les maladies cardiovasculaires sont la cause principale de décès de nos jours. En réponse à un infarctus du myocarde (IM), les vésicules extracellulaires (VEs)- grandes (gVEs) et petites (pVEs), sont libérées au niveau cardiaque et contribuent à la communication intercellulaire ainsi qu' au maintien de l'homéostasie cardiaque en transférant leur contenu tel que les microARNs (miARNs). De plus, il est reconnu que le diabète de type 2 augmente le risque de maladies cardiovasculaires. Ainsi, le but de ces travaux est d'étudier l'influence du diabète de type 2 sur la libération de VE intracardiaques post-IM et de déterminer leur contenu en miARNs. Des souris mâles ont reçu un régime alimentaire normal ou un régime riche en graisses (High Fat Diet - HFD) pendant 3 mois. L'infarctus a été induit par une ligature permanente de l'artère coronaire. L'analyse a consisté en une quantification de façon cinétique des VEs en fonction des conditions expérimentales (IM et/ou HFD). Les VEs ont été isolées par centrifugations différentielles et quantifiées par la technologie TRPS. L'origine de ces VEs en termes de leurs cellules parentales et la caractérisation des VEs ont été déterminées par cytométrie en flux et Western Blot (WB). Le contenu en miARN des VEs a été déterminé par séquençage d'ARN et puis validé par qPCR. L'analyse du tropisme des VEs à été réalisé en co-cultivant des VEs issues de culture de lignées cardiomyocytaires (HL-1), soumises à une hypoxie pour mimer l'IM, avec des splénocytes. L'analyse en cytométrie en flux a permis d'identifier les cellules réceptrices des VEs cardiomyocytaires. En utilisant des souris cardiaques alpha-actine GFP+, les VEs circulantes ont été isolées et analysées par cytométrie en flux pour déterminer si les VEs GFP+ dérivées de cardiomyocytes sont libérées dans la circulation pour se rendre aux cibles prévues. Les miARNs d'intérêt seront étudiés in vitro pour identifier leur fonction biologique. Chez les souris contrôles, la libération des gVEs et pVEs intracardiaques est significativement augmentée à 24H post-IM par rapport aux animaux shams (opérés mais sans IM). Les animaux ayant été soumis à un HFD présentent un niveau des gVEs significativement plus élevé par rapport aux animaux shams et animaux contrôles post-IM. Aucune différence n'existe concernant la libération de pVEs chez les animaux diabétiques quel que soit le statut opératoire. L'analyse par cytométrie en flux a montré que la majorité des gVEs intracardiaques exprimait la cavéoline-3, un marqueur d'origine cardiomyocytaire. De plus la caractérisation par WB confirme la présence de marqueurs vésiculaires mais également d'un marqueur cardiomyocytaire (Troponine T cardiaque). L'analyse par séquençage d'ARN a mis en évidence des profils de régulation différentielle de miARNs en fonction du diabète et du statut ischémique dans les deux types de VEs. L'analyse quantitative par qPCR a démontré i) une diminution des taux de miR-146a-5p et -503-5p dans les gVEs dérivées d'HFD vs contrôles et ii) une augmentation des taux de miR-378a-5p dans les deux sous-types de VEs quel que soit le statut des animaux en réponse à l'IM. L'analyse des co-cultures de splénocytes avec les VEs issues d'HL-1 a i) révélé un tropisme préférentiel par les cellules myéloïdes et ii) une augmentation de ce tropisme dans les splénocytes issus d'animaux diabétiques. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour définir précisément les sous-populations myéloïdes spléniques ciblées. Nos résultats démontrent que le diabète module la libération des VEs intracardiaques post-IM, ainsi que leur contenu en miARN. En outre, le diabète augmente également la libération de VEs dérivées des cardiomyocytes dans la circulation ainsi que leur transfert aux cellules myéloïdes spléniques. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour étudier l'impact fonctionnel des miARNs d'intérêt dans les VEs intracardiaques du coeur diabétique post-IM.

Cardiovascular disease is the main cause of death in non-communicable diseases. In response to myocardial infarction (MI), extracellular vesicles (EVs), including large (lEVs) and small (sEVs), are released within and from the heart to facilitate intercellular communication and maintain cardiac homeostasis by transferring their content such as miRNA, to recipient cells. As diabetes increases the risk of cardiovascular diseases, the purpose of the study was to investigate how diabetes influences the release of intracardiac EVs post-MI and to determine the miRNA content of these EVs. BL/6J male mice were fed normal chow diet or high-fat diet (HFD) for 3 months. MI was induced by coronary artery permanent ligation. Left ventricles were harvested at different timepoints post-surgery and processed for EV isolation by differential centrifugation. EVs were quantified via Tunable Resistive Pulse Sensing Technology (TRPS). Parental cell origin and EV characterisation were determined by flow cytometry and Western blot. Intracardiac EV miRNA content was determined by RNAseq and validated by qPCR. As MI and diabetes involve persistent inflammatory responses, EVs from hypoxic cardiomyocyte cell line (HL-1) were co-cultured with splenocytes of HFD/control MI mice to determine EV preferential target cells. Using specific cardiac alpha-actin GFP+ (green fluorescent protein) mice, circulating EVs were isolated and analysed by flow cytometry to observe whether GFP+ cardiomyocyte-derived EVs are indeed released into the circulation to travel to intended targets. The miRNA(s) of interest will be investigated further in vitro for its functional impact. In control mice, release of lEVs and sEVs was significantly increased at 24h post-MI when compared to sham animals. Similarly, levels of lEVs in HFD mice were significantly higher compared to sham and control mice post-MI. There were no differences in sEV release between sham and MI diabetic mice. TRPS analysis revealed that diabetes does not alter EV size/population. High-sensitivity flow cytometry demonstrated that the majority of intracardiac lEVs expressed caveolin-3, a marker of cardiomyocyte origin. Both control and HFD mice derived EVs also harboured cardiac Troponin T and EV markers such as tetraspanin (CD9) and cytosolic markers (HSC70). RNAseq revealed that different miRNAs were upregulated in lEVs and sEVs in MI mice as compared to sham, indicating difference in content of the 2 types of EVs. qPCR analysis demonstrated the downregulation of miR-146a-5p and -503-5p expression in HFD derived lEVs compared to control and the upregulation of miR-378a-5p expression in both EV subsets. Levels of intracardiac GFP+Cav-3+ lEVs were lower in HFD than in control mice, whereas levels of circulating GFP+Cav-3+ lEVs were higher in HFD than in control mice. Co-culture of splenocytes isolated from HFD and control mice post-MI with HL1 EVs revealed a preferential uptake by myeloid cells, with an increase in uptake in diabetic spleens than in control spleens post-MI. Further investigations are needed to define specific targeted splenic myeloid subpopulations. Our results demonstrate that diabetes modulates the release of intracardiac EVs post-MI, as well as their miRNA cargo. Furthermore, diabetes also increases the release of cardiomyocyte-derived EVs into the circulation as well as their uptake by splenic myeloid cells. Further work is warranted to fully investigate the functional impact of the miRNA of interest in intra-cardiac EVs in the diabetic heart post-MI.