Traitements maternels au long cours et développement foeto-placentaire : impact des inhibiteurs de protéases anti-VIH sur la fonction endocrine placentaire, in vitro

Long-term maternal therapy and feto-placental development : impact of anti-HIV protease inhibitors on the placental endocrine function in vitro

• Auteur / Autrice : Camille Fraichard
• Direction : Jean Guibourdenche
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 03/12/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiopathologie & pharmacotoxicologie placentaire humaine (Microbiote pré & post natal ; Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Marie-Noëlle Dieudonné
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Noëlle Dieudonné, Michaël Schumacher, Séverine Mazaud-Guittot, Ioana Ferecatu, Jeanne Sibiude
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Michaël Schumacher, Séverine Mazaud-Guittot

Mots clés

Mots clés contrôlés

VIH (virus)

Progestérone

Stéroïdogenèse

Placenta

Mots clés libres

Placenta humain

HCG

Stéroïdogenèse

Progestérone

Mitochondrie

Inhibiteur de protéase

Lopinavir

Stress du réticulum endoplasmique

VIH

Grossesse

Human placenta

HCG

Steroidogenesis

Progesterone

Mitochondria

Protease inhibitor

Lopinavir

Endoplasmic reticulum stress

HIV

Pregnancy

Résumé

Le nombre de grossesse se déroulant dans un contexte de traitement maternel au long cours, notamment pour les antirétroviraux (ARV) contre l'infection par le Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH), augmente constamment. Des études ont montré que ces traitements entrainaient des complications obstétricales, des fausses couches et des naissances prématurées. D'autres ont établi que les traitements anti-VIH, notamment les inhibiteurs de protéases (IP), altéraient la production d'hormones stéroïdes à la fois chez la mère et le fœtus. Les mécanismes intracellulaires responsables de ces altérations restent mal connus et peu de choses a été décrit au niveau du placenta humain, alors que la fonction endocrine placentaire est indispensable au bon déroulement de la grossesse. La production des hormones placentaires comme l'hormone chorionique gonadotrope humaine (hCG) et la progestérone (P4) est assurée le tissu trophoblastique villeux au sein de la villosité choriale, principalement le syncytiotrophoblaste (ST). Le ST qui est en contact direct avec le sang maternel, résulte de la différenciation des cytotrophoblastes villeux (CTV), processus que nous savons reproduire in vitro au laboratoire. Nous postulons que les complications des grossesses sous ARV impliquent pour partie, une altération de la différenciation morphologique et fonctionnelle du trophoblaste villeux. Notre premier objectif a été de caractériser la stéroïdogenèse placentaire sur culture primaire de trophoblastes villeux humain normaux à terme, et ce dès le stade CTV. Nous avons développé les outils pour évaluer au cours de la différenciation trophoblastique, la sécrétion des principales hormones placentaires (hCG, P4, oestradiol [E2]) dans les surnageants de culture par immunodosages et spectrométrie de masse, et leur synthèse (analyse des partenaires cellulaires impliqués en terme de transcrits et protéines, organelles cellulaires concernés). Le second objectif a été d'étudier in vitro l'impact des principaux IP prescrits (ritonavir et lopinavir) sur cette différenciation, les mécanismes et organelles intracellulaires affectés. Nous nous sommes focalisés sur la progestérone, la mitochondrie et sur deux voies de signalisation, la voie « Unfolded Protein Response » et la voie AMPc/PKA. Nous avons montré que la stéroïdogenèse placentaire n'était pas l'apanage du seul ST mais débutait dès le stade CTV. Le CTV exprime les partenaires clés de la synthèse de P4 à savoir le transporteur du cholestérol (MLN64) et les enzymes (P450SCC et HSD3B1). Leur expression augmente avec la différenciation morphologique des CTV en ST et s'accompagne d'une augmentation de la sécrétion de P4. Cette augmentation est corrélée à celle de la sécrétion d'hCG, suggérant une inter-régulation entre hCG et P4 dans ce processus de différenciation. Nous avons ensuite montré que parmi les 2 principaux IP étudiés, seul le lopinavir altérait la différenciation dès la dose de 10 uM. On observe en effet sur le plan morphologique une diminution de la fusion des CTV pour former du ST, qui s'accompagne d'une diminution de la sécrétion d'hCG. La production de P4 est aussi diminuée tant en terme de sécrétion que de synthèse (diminution de l'expression de P450SCC et HSD3B1). Le LPV altère la structure et la dynamique de fusion/fission des mitochondries avec une diminution de l'expression de la protéine Mfn2. Le LPV induit un stress du RE avec activation de la voie UPR IRE1a. Ainsi, nous avons établi que le trophoblaste villeux humain normal à terme était capable dès le stade CTV in vitro, de produire de l'hCG mais aussi de la P4, et que cette production augmentait avec sa différenciation en ST. Le LPV altère cette différenciation et impacte la mitochondrie et le RE. Il en résulte une diminution de la production de P4 et d'hCG, hormones indispensables à la grossesse, qui pourrait expliquer les complications obstétricales des patientes HIV+ traitées comme la prématurité et les fausses couches.

The number of pregnancies occurring in the context of long-term maternal treatment, including antiretroviral (ARV) therapy for human immunodeficiency virus (HIV) infection, is steadily increasing. Previous studies have shown that these treatments can lead to obstetric complications, miscarriages and premature births. Others have reported that HIV treatments, including protease inhibitors (PIs), alter the production of steroid hormones both in mother and fetus. The intracellular mechanisms responsible for these alterations remain poorly understood and little has been described about the role of human placenta, although placental endocrine function is essential for the physiological progress of pregnancy. The production of placental hormones such as human chorionic gonadotropic hormone (hCG) and progesterone (P4) is ensured by the trophoblastic tissue within the chorionic villus, mainly the syncytiotrophoblast (ST). The ST, which is in direct contact with maternal blood, results from the differentiation of the villous cytotrophoblast (VCT), a process that we are able to reproduce in vitro in the laboratory. We postulated that the complications of pregnancies under ARVs result, in part, from an alteration of the morphological and functional differentiation of the villous trophoblast. Our first objective was to characterize placental steroidogenesis on primary culture of normal human villous trophoblasts at term, starting at the VCT stage. We developed tools to evaluate the secretion of the main placental hormones (hCG, P4, estradiol [E2]) in culture supernatants during trophoblastic differentiation using immunoassays and mass spectrometry, and their synthesis (analysis of the cellular partners in terms of transcripts and proteins , and of the cellular organelles involved). The second objective was to study in vitro the impact of the main prescribed PIs (ritonavir and lopinavir) on this differentiation as well as the mechanisms and intracellular organelles affected. We focused on progesterone, mitochondria and two signaling pathways, the Unfolded Protein Response pathway and the cAMP/PKA pathway. We showed that placental steroidogenesis was not exclusive to ST alone but started as early as the VCT stage. VCT expresses the key partners in P4 synthesis, namely the cholesterol transporter (MLN64) and the enzymes (P450SCC and HSD3B1). Their expression increases with the morphological differentiation of VCT in ST and is associated with an increase in P4 secretion. This increase correlates with hCG secretion increase, suggesting an inter-regulation between hCG and P4 in this differentiation process. We then showed that among the 2 main PIs studied, only lopinavir altered differentiation as early as the 10 uM dose. Indeed, morphologically, a decrease in VCT fusion to form ST was observed, associated with a decrease in hCG secretion. P4 production was also decreased both in terms of secretion and synthesis (decreased expression of P450SCC and HSD3B1). LPV altered the structure and fusion/fission dynamics of mitochondria with a decrease in the expression of Mfn2 protein. LPV induced ER stress with activation of the UPR IRE1a pathway. Thus, we established that the normal human villous trophoblast is able in vitro to produce hCG but also P4 and that this production increases with its differentiation into ST. LPV alters this differentiation and affects both mitochondria and ER. The result is a decrease in the production of P4 and hCG, hormones essential for pregnancy, which could explain the obstetric complications,such as prematurity and miscarriage, of HIV+ patients treated.