Caractérisation d'une mutation homozygote dans le gène EOMES chez une patiente ayant une susceptibilité à l'EBV

Identification of a homozygous EOMES mutation in a patient with high susceptibility to EBV infection

• Auteur / Autrice : Camille Bachelet
• Direction : Claire Soudais
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 12/11/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Sylvain Latour
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sylvain Latour, Thierry Walzer, Pauline Soulas-Sprauel, Isabelle Meyts
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Thierry Walzer, Pauline Soulas-Sprauel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Déficit immunitaire

Virus d'Epstein-Barr

Mutation (biologie)

Mots clés libres

Immunologie

Déficit immunitaire

EBV

CA-EBV

EOMES

Immunology

Immune deficiency

EBV

CA-EBV

EOMES

Résumé

Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est un oncovirus qui infecte de manière asymptomatique 90% de la population humaine Il est responsable de 1,5% des cancers dans le monde. Les cancers associés à l'infection par l'EBV sont majoritairement des lymphomes B et également des cancers épithéliaux. Dans de très rares cas, l'EBV peut également infecter les lymphocytes T et NK, entrainant une maladie nommée CA-EBV. Ces patients se caractérisent par une virémie élevée et persistante, ils développent très fréquemment un lymphome T/NK accompagné d'un syndrome inflammatoire d'hémophagocytose. Notre laboratoire étudie les déficits immunitaires primaires associés à une susceptibilité à l'EBV. L'identification de nouveaux gènes de susceptibilité a permis de mieux comprendre les mécanismes et facteurs impliqués dans le contrôle de cette infection. Nous avons étudié une patiente âgée de 3 ans présentant une lymphoprolifération des lymphocytes T au cours d'une primo infection par l'EBV. Elle est rapidement décédée d'un lymphome T dans un contexte hémophagocytose. Un marquage histologique a mis en évidence une infection des lymphocytes T par l'EBV. Grâce à l'analyse génomique par Whole Exome Sequencing, nous avons pu mettre en évidence une mutation homozygote dans le gène EOMES. Cette mutation, retrouvée à l'état hétérozygote chez ses parents, était considérée comme la plus délétère sur la base de son CADD score et elle était la seule affectant un gène avec un rôle avéré dans le système immunitaire. Nous avons entrepris de tester un possible rôle causal de cette mutation dans la pathologie de notre patiente. Le gène EOMES code pour un facteur de transcription de la famille des protéines possédant un domaine de liaison à l'ADN : T-box. EOMES est impliqué dans le développement embryonnaire et dans le système immunitaire. Chez l'homme, il a été montré que EOMES s'exprime dans les lymphocytes T CD8 effecteurs et effecteurs mémoires ainsi que dans les cellules NK, qui sont les cellules clés de la réponse contre les virus et pathogènes intracellulaires. EOMES permettrait aux lymphocytes T d'acquérir un phénotype mémoire et serait impliqué dans l'acquisition des fonctions effectrices : production d'interféron-g, expression de la perforine et du granzyme B. Plusieurs modèles de souris ont été développés pour étudier le rôle d'Eomes. La souris Eomes Knock-out (KO) présente un phénotype létal à l'état embryonnaire indiquant son importance dans lors développement des tissus embryonnaires. Par la suite, une souris KO conditionnel permettant la délétion d'Eomes dans les lymphocytes T a été développée. Le rôle d'EOMES dans le contrôle d'une infection au virus LCMV a été étudié, montrant qu'en absence de EOMES les souris présentent une diminution des cellules CD8 effectrices mémoires et un mauvais contrôle de l'infection. Le but de la thèse a été d'étudier l'impact de cette mutation. Pour cela nous avons utilisé des modèles cellulaires dans lesquelles la forme sauvage ou mutée de la protéine a été introduite et nous avons développé un modèle de souris Knock-In (KI) par CRISPR-Cas9. Nous avons étudié les capacités de fixation à l'ADN et de transcription de la protéine mutante par des techniques d'EMSA et d'activation d'un gène rapporteur luciferase via un promoteur contenant un site de fixation d'EOMES. La protéine mutée est capable de se fixer à l'ADN et d'entrainer de la transcription au même niveau que la protéine sauvage. L'étude de la localisation nucléaire a montré que la forme mutée forme des foci ou agrégats qui ne sont pas retrouvés avec la forme sauvage. Nous avons ensuite étudié l'impact de la mutation les lymphocytes T CD8 et des cellules NK dans le modèle de souris KI. Le phénotype et les fonctions effectrices de T CD8 et NK (production de cytokines, dégranulation, cytotoxicité, réponse mémoire) ont été étudiées dans les modèles cellulaires et chez la souris. Une étude de la réponse anti-virale a aussi été entreprise après infection par le LCMV.

Epstein-Barr virus (EBV) is an oncovirus that asymptomatically infects 90% of the human population. EBV is responsible for 1.5% of cancers worldwide. The cancers associated with EBV infection are predominantly B lymphomas and also epithelial cancers. In very rare cases, EBV can also infect T cells, causing a condition called CA-EBV. These patients are characterized by high and persistent viremia and very frequently develop T-cell lymphoma accompanied by an inflammatory hemophagocytosis syndrome. Several immunodeficiencies linked to EBV infection have made possible a better understanding of the mechanisms and factors involved in the control of this infection. Our laboratory studies primary immune deficits associated with susceptibility to EBV. We recently studied a 3-year-old patient with T-cell lymphoproliferation during a primary EBV infection. She died quickly of T lymphoma associated with hemophagocytosis. Histological labeling revealed infection of T lymphocytes by EBV. By Whole Exome Sequencing, we were able to highlight an homozygous mutation in the EOMES gene. This mutation was considered the most deleterious on the basis of its CADD score and it was the only one affecting a gene with a proven role in the immune system. The mutation is also found, at the heterozygous state, in the parents of the patient. We thus decided to test a possible causal role of this mutation in the pathology of our patient. The EOMES gene codes for a transcription factor that is part of a family of proteins that share a DNA binding domain: the T-box domain. EOMES is involved in embryonic development and in the immune system. Its role has been shown in the activation of effector cells, which are key cells of the response against viruses and intracellular pathogens. EOMES has been shown to be expressed in humans in CD8 effector and memory T effector cells as well as in NK cells. EOMES would allow T lymphocytes to acquire a memory phenotype and would be involved in the acquisition of effector functions: production of interferon-g, expression of perforin and granzyme B. Several mouse models have been developed to study the role of Eomes. The Eomes Knockout (KO) mouse exhibits a lethal embryonic phenotype indicating its importance in the development of embryonic tissue. Subsequently, a conditional KO mouse allowing the deletion of Eomes in T lymphocytes was developed. The role of EOMES in controlling LCMV infection has been studied, showing that in the absence of EOMES mice exhibit a decrease in memory effector CD8 cells and poor control of the infection. The aim of the thesis was to study the impact of this mutation. For this we have used in vitro cell models in which the wild type or mutated form of the EOMES protein has been introduced and we have developed a Knock-In (KI) mouse model, which reproduces the mutation of the patient, by CRISPR-Cas9. We first investigated the DNA binding and transcription capabilities of the mutant protein using EMSA and activating a luciferase reporter gene containing an EOMES binding site. The mutated protein is capable of binding to DNA and causing transcription at the same level as wild-type protein. The study of nuclear localization has shown that the mutated form forms foci or aggregates which are not found with the wild form. We then studied the impact of the mutation on CD8 T lymphocytes and NK cells in the KI mouse model. The phenotype and effector functions (production of cytokines, degranulation, cytotoxicity, memory response) have been studied in cell line models and in mice. A study of the anti-viral response has also been undertaken after infection with LCMV.