Modélisation cellulaire d'un nouveau type d'hypoplasie pontocérébelleuse causé par une perte de fonction du gène multiple inositol-polyphosphate phosphatase 1

Cellular modelling of a new type of Pontocerebellar Hypoplasia caused by a defect in the multiple inositol-polyphosphate phosphatase 1 gene

• Auteur / Autrice : Ekin Ucuncu
• Direction : Vincent Cantagrel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 09/11/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Nadia Bahi-Buisson
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nadia Bahi-Buisson, Anselme Perrier, Christophe Erneux, Lydie Burglen
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Anselme Perrier, Christophe Erneux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Métabolisme

Inositol phosphates

Hypoplasie pontocérébelleuse

Modèles mathématiques

Cytologie

Mots clés libres

Génétique

Neuro-Développement

Cellules souches pluripotentes induites

Genetics

Neurodevelopment

Induced pluripotent stem cells

Résumé

Les anomalies du développement du cervelet sont associées à des troubles cognitifs et moteurs, et pour une part importante des patients atteints il n'y a pas de diagnostic moléculaire. Parmi celles-ci, les hypoplasies pontocérébelleuses (HPC) sont des maladies rares, très sévères, caractérisées par un développement incomplet du cervelet et du tronc cérébral. Récemment, nous avons identifié des mutations dans un nouveau gène, MINPP1 (pour multiple inositol-polyphosphate phosphatase 1), chez huit patients issus de six familles. Ces patients présentent une image typique à l'IRM avec une atteinte des ganglions de la base, suggérant un nouveau défaut moléculaire. Etonnamment, la voie métabolique des inositol phosphates n'a jamais été impliquée dans des maladies congénitales ni dans le développement cérébral humain. Mon projet de thèse a visé à établir des modèles d'étude de la maladie à l'aide de cellules HEK293, de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi) ainsi que la souris invalidée pour Minpp1. Pour évaluer l'effet des variants de MINPP1 identifiées chez les patients HPC, nous avons commencé notre projet en générant un modèle de cellules HEK293 invalidées pour MINPP1. Les cellules HEK293 MINPP1-/- montrent un défaut de prolifération, qui est partiellement sauvé par une surexpression de MINPP1 WT. En revanche, la surexpression des deux variants faux-sens de MINPP1 identifiés chez les patients, n'a aucun effet, indiquant que ces variants sont des mutations perte de fonction. Afin d'établir un modèle cellulaire plus proche de la maladie, nous avons généré des cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi) invalidées pour MINPP1. Parallèlement, nous avons aussi généré des CSPi provenant de patients HPC. Nous avons ensuite analysé la capacité de différentiation en neurones de ces deux lignées. Nous avons constaté une forte augmentation dans le pourcentage des progéniteurs neuronaux ainsi qu'une diminution dans le pourcentage des neurones positifs pour Tuj1, suggérant un retard de différentiation neuronale sévère dans ces deux lignées. De plus, nous avons observé une augmentation de la mort cellulaire dans ces lignées lors de cette différentiation. Afin d¿étudier les voies biochimiques impliquées dans ces défauts neurologiques, nous avons quantifié les inositol phosphates intracellulaires et observé une augmentation du taux d'IP6 lors de la différenciation neuronale des deux lignées mutantes pour MINPP1.Par la suite, nous avons testé un mécanisme expliquant comment l'accumulation d'IP6 affecte la différenciation neuronale et la survie cellulaire observées dans des lignées mutantes pour MINPP1. Comme l'IP6 est un fort chélateur, nous avons émis l'hypothèse que l'accumulation d'IP6 cause un déséquilibre dans l'homéostasie des ions intracellulaires importants pour la différenciation neuronale et la survie cellulaire. En effet, nos premières analyses avec le modèle HEK293 KO MINPP1, montrent une forte diminution de Ca2+ et Fe3+ libres intracellulaires, tout en affichant un taux d'IP6 élevés. Conformément à ces résultats, les progéniteurs neuronaux de souris Minpp1-/- montrent aussi une diminution marquée de Ca2 + libre intracellulaire. Par conséquent, ces données suggèrent l'implication de la chélation médiée par IP6 comme cause sous-jacente de cette pathologie. Ainsi, ce projet a permis d'identifier un nouveau gène de HPC et les mécanismes biochimiques et cellulaires associés et ainsi démontrer, pour la première fois, l'implication d'une anomalie du métabolisme des inositol phosphates dans les HPC et dans une maladie congénitale.

Developmental defects of the cerebellum cause both motor and cognitive symptoms. They are highly heterogeneous at the genetic level and most cases are not diagnosed yet. Pontocerebellar hypoplasia (PCH) is a group of rare recessive disorders, characterized mainly by degeneration and lack of proper development of the pons and the cerebellum. Clinical features vary widely, including 13 subtypes, and the genetic basis is still not known for all of the subtypes. In this disease, early-onset neurodegeneration intersects with neurodevelopment and pathological mechanisms are poorly understood. Recently, we identified 8 PCH patients from six independent families, all harboring loss of function (LOF) mutations in a novel disease causing gene: multiple inositol-polyphosphate phosphatase 1 (MINPP1). All of the 8 patients shared a never described neuroradiological phenotype that includes basal ganglia involvement, hence pointing out a new PCH subtype. Strikingly, the inositol polyphosphate metabolism pathway has been directly involved neither in human brain development nor in any Mendelian disorders. Thus, this study sought to model MINPP1-PCH using cellular and mouse models including HEK293 cells, iPSCs and Minpp1-/- mice. To assess the effect of PCH-associated MINPP1 mutations, we started our project by generating a knock-out model for MINPP1 in HEK293 cells. MINPP1-/- HEK293 cells showed a proliferation defect, which was partially rescued by overexpression of WT MINPP1. Contrastingly, overexpression of MINPP1 missense PCH variants did not rescue the proliferation phenotype, indicating that all of the missense variants tested are deleterious for protein function and hence suggesting a LOF. To better understand the involvement of LOF of MINPP1 in PCH aetiology, we then derived iPSCs from one of the patients harbouring homozygous early-truncating mutations in MINPP1. Subsequently, to have an isogenic control, we generated MINPP1-/- iPSCs. To obtain the disease relevant cell types, we further differentiated them towards neuronal lineage. Interestingly, both MINPP1 mutant lines displayed delayed neuronal differentiation associated with enhanced apoptosis. To better understand the biochemical mechanisms underlying these defects, we performed inositol metabolic radiolabelling to quantify intracellular inositol phosphate levels during differentiation. Intriguingly, both MINPP1 mutant lines exhibited a disruption in inositol phosphate homeostasis, with a robust increase in IP6 levels during differentiation. Hence, these data showed that the absence of MINPP1 leads to IP6 accumulation during neuronal differentiation. Next, we tried to understand how this biochemical defect related to a ubiquitous enzyme could cause these neurological phenotypes. Given IP6's strong ion-chelating characteristic, we hypothesize that IP6 accumulation in some cellular compartments could chelate some divalent cations and cause an intracellular depletion of these free ions. Such depletion could alter neuronal differentiation and enhance neuronal degeneration. In support of this hypothesis, MINPP1-/- HEK293 cells showed a robust decrease in free intracellular Ca2+ and Fe3+ levels, while displaying a marked increase in IP6 levels. Hence, these data suggested that IP6 accumulation leads to a disruption in intracellular cation homeostasis. To assess its involvement and further characterize such mechanism, a mouse model KO for the Minpp1 gene was created in the lab. In line with the results from HEK293 cell model, Minpp1-/- mouse neural progenitors showed a marked decrease in free intracellular Ca2+ levels. Thus, these data suggest the involvement of IP6-mediated chelation as the underlying cause of MINPPI-PCH pathology. Hence, this study provides novel insights into the genetic, molecular and phenotypic spectrum of PCH by demonstrating for the first time the involvement of an abnormal inositol phosphate metabolism as a cause of PCH and a human developmental disorder.