Génétique et épigénétique de l'endométriose : analyse des micro-ARNs et séquençage de familles

Genetics and epigenetics of endometriosis : analysis of microRNAs and family sequencing

• Auteur / Autrice : Carole Abo
• Direction : Bruno Borghese, Daniel Vaiman
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 05/10/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cochin (Paris ; 2002-....)
• Jury : Président / Présidente : François Vialard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François Vialard, Marina Kvaskoff, Nadège Bercovici, Cyril Touboul
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : François Vialard, Marina Kvaskoff

Mots clés

Mots clés contrôlés

Exome

MicroARN

Épistémologie génétique

Génétique

Endométriose

Mots clés libres

Endométriose

Génétique

Épigénétique

Polymorphisme

Familles

Séquençage

Exome

Micro-ARN

Bioinformatique

Transfection

Biomarqueur

Endometriosis

Genetics

Epigenetics

Polymorphisms

Family

Sequencing

Exome

Micro-RNA

Bioinformatics

Transfection

Biomarker

Résumé

L'endométriose est une pathologie gynécologique chronique, inflammatoire et hormono-dépendante, définie par la présence de tissu endométrial fonctionnel en dehors de la cavité utérine. Elle affecte environ 10% des femmes en âge de procréer et peut occasionner des douleurs pelviennes et une infertilité. C'est une maladie complexe dont l'étiologie et la physiopathologie demeurent mal connues. La première partie de ce travail concerne les bases génétiques de l'endométriose qui est une maladie répondant à une hérédité multigénique. À ce jour, les études d'association pangénomiques n'ont mis en évidence que des variants d'effets relativement modestes, dans des formes non familiales. Nous proposons ici une approche fondée sur l'étude de familles concentrant des cas sévères, dans le but de mettre en évidence de nouveaux polymorphismes affectant possiblement des gènes majeurs. Quatre-vingt cinq familles présentant au moins deux cas d'endométriose sévère ont été sélectionnées. Un prélèvement d'ADN a été réalisé pour chaque malade de la famille, ainsi que les parents des sujets atteints, puis les régions codantes (exomes) ont été séquencées. La mise en évidence d'un ou plusieurs variants dans ces formes familiales pourrait permettre de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans la maladie et peut-être poser les bases d'un dépistage familial. La deuxième partie de ce travail s'intéresse aux mécanismes épigénétiques de l'endométriose et plus particulièrement aux micro-ARNs. S'il est clair que leur expression est dérégulée dans l'endométriose, l'identification des micro-ARNs en cause est loin d'être achevée, les études publiées à ce jour étant discordantes entre elles. À l'aide d'une approche bioinformatique originale et sans a priori, s'appuyant sur les données de la base miRWalk 2.0 couplées aux données d'expression de kystes ovariens endométriosiques (endométriomes), nous avons identifié 8 micro-ARNs potentiellement régulateurs. Étant donné la forte corrélation existant entre la concentration tissulaire et circulante des micro-ARNs, les 8 micro-ARNs sélectionnés ont été quantifiés par RT-qPCR dans le plasma de 93 patientes et 95 témoins indemnes de la maladie. Deux sur les huit testés étaient surexprimés chez les patientes endométriosiques : let-7b-5p et miR-92a-3p (p<0.005). Trois micro-ARNs parmi les 8 sélectionnés, incluant let7b-5p et miR-92a-3p, ciblaient potentiellement le gène KIAA1324, l'un des plus dérégulés dans l'endométriome et dont l'expression est modulée par les oestrogènes. Nous avons ensuite réalisé des cultures primaires de cellules endométriales à partir de biopsies d'endomètre de 10 femmes porteuses d'un endométriome. Ces cellules ont été transfectées avec des mimics de micro-ARNs (let-7b-5p et miR-92a-3p) afin d'étudier leur effet sur l'expression de KIAA1324. L'expression du gène KIAA1324 a été mesurée par RT-qPCR et une baisse d'expression allant jusqu'à 40% a été observée en présence des deux micro-ARNs testés. L'analyse immunohistochimique comparant la lésion ovarienne à l'endomètre eutopique d'une même patiente a révélé un marquage moins intense de KIAA1324 dans la lésion par rapport à l'endomètre, ce qui est en accord avec les données transcriptomiques. En conclusion, nous avons mis en évidence l'implication potentielle d'un nouveau gène dans la physiopathologie de l'endométriose, le gène KIAA1324 dont l'expression est diminuée par deux micro-ARNs circulants, let-7b-5p et miR-92a-3p. Ces deux micro-ARNs ont été retrouvés surexprimés dans la maladie; leur quantification dans le plasma pourrait constituer un outil de diagnostic précoce dans l'endométriose.

Endometriosis is a chronic, inflammatory and hormono-dependent gynecological disease, defined by the presence of functional endometrial tissue outside the uterine cavity. It affects around 10% of women of childbearing age and possibly causes pelvic pain and infertility. It is a heterogeneous disease; its etiology and pathophysiology remain poorly understood. The first part of this work deals with the genetic basis of endometriosis, that is considered a complex trait. To date, genome-wide association studies have only revealed genomic variants with a slight effect, in non-familial forms. We propose an approach based on the analysis of families harboring multiple and severe cases, in order to highlight not ever described polymorphisms, possibly afflicting gene expression with a major effect. Eighty-five families with at least two cases of severe endometriosis were selected. A sample of genomic DNA was taken from each subject, including their parents, and submitted to exome sequencing. Identification of variants in these familial forms may allow to focus on new genes possibly involved in the disease and draw the basis of familial screening. The second part of this work focuses on the epigenetic mechanisms of endometriosis, particularly on micro-RNAs (miRNAs). While their expression is clearly deregulated in endometriosis, precise identification of the miRNAs involved in the disease is still to be achieved, as the studies published so far have produced discordant results. Using an original and unbiased bioinformatics approach based on miRWalk 2.0 database and transcriptomic data from endometriotic ovarian cysts (endometriomas) we identified 8 putative miRNAs. Given the strong correlation between the tissue and plasma concentration of the miRNAs, we quantified these miRNAs by RT-qPCR in the plasma of 93 patients and 95 healthy controls. Two miRNAs were upregulated inpatients: let-7b-5p and miR-92a-3p (p <0.005). Three miRNAs, including let7b-5p and miR-92a-3p, potentially targeted KIAA1324, an estrogen-regulated gene and one of the most deregulated genes in endometrioma. We then performed primary endometrial cells cultures from endometrial biopsies of 10 women with endometrioma. These cells were transfected with miRNAs mimics (let-7b-5p and miR-92a-3p) in order to study their effect on the expression of KIAA1324. KIAA1324 expression was measured by RT-qPCR and a strong decrease of about 40% was observed in the presence of these two miRNAs. Immunohistochemistry assay of KIA1324c in endometrioma as compared to eutopic endometrium of the same patient revealed a fainter staining of KIAA1324 in the lesion as compared to the endometrium, which is concordant with the transcriptomic data. In conclusion, we have revealed the putative implication of a new gene in the pathophysiology of endometriosis, KIAA1324 whose expression is reduced by two circulating microRNAs, let-7b-5p and miR-92a-3p. These two microRNAs were found to be upregulated in the disease; their quantification in plasma could provide a tool for early diagnosis in endometriosis.