Réplication et séquestration du VIH-1 dans les macrophages

HIV-1 replication and sequestration in macrophages

• Auteur / Autrice : Leslie Lepont
• Direction : Clarisse Berlioz-Torrent
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 30/09/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cochin (Paris ; 2002-....)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Emmanuel Ceccaldi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre-Emmanuel Ceccaldi, Lucile Espert, Frank Lafont, Florence Margottin-Goguet, Harald Wodrich
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Lucile Espert, Frank Lafont

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus -- Reproduction (biologie)

Macrophages

VIH (virus)

Mots clés libres

VIH-1

Macrophages primaires humains

Facteur de restriction

BST2

Vpu

VCC

Séquestration virale

LAP

LC3

ATG5

HIV-1

Primary human macrophages

Restriction factor

BST2

Vpu

VCC

Viral sequestration

LAP

LC3

ATG5

Résumé

Le virus de l'immunodéficience humaine, VIH-1, infecte actuellement 37,9 millions de personnes à travers le monde et l'on estime à 32 millions le nombre de décès dus à ce virus depuis le début de l'épidémie. L'un des enjeux actuels est de purger les réservoirs viraux, obstacles à la guérison complète. Ces réservoirs sont majoritairement constitués de lymphocytes T CD4 dans lesquels l'expression du génome viral est réprimée. Les macrophages constituent aussi des sanctuaires viraux, archivant des virions pleinement infectieux dans des vésicules intracellulaires (VCC) pendant de longues périodes de temps, et ce, même chez des patients sous traitement antirétroviral. Les VCC sont des structures à pH neutre résultant de l'invagination de la membrane plasmique. Elles sont enrichies en molécules CD81, CD63, CD53, CD36, CD9, CMH-II, Siglec1 mais aussi en BST2/Tetherin. BST2 est un facteur de restriction du VIH-1. Il retient physiquement les virus bourgeonnant à la membrane, les empêchant de disséminer. Face à cette restriction, le VIH-1 a évolué et sa protéine Vpu est capable de contrer l'action restrictive de BST2. Ainsi, Vpu modifie le trafic intracellulaire de BST2, diminue son expression de surface et le cible vers la dégradation lysosomale. De plus, le VIH-1 engage un mécanisme d'autophagie non canonique, semblable à la phagocytose médiée par LC3 (LAP), pour contrer BST2. Dans ce mécanisme, Vpu recrute la protéine d'autophagie LC3C et engage un processus de LAP-like, accélérant la phagocytose de BST2 présent en surface. De façon intéressante, nous avons observé que l'extinction de LC3C dans les cellules HeLa provoque la séquestration de virions dans un compartiment intracellulaire à simple membrane, semblable aux VCC des macrophages. Ces résultats nous ont conduits à émettre l'hypothèse que les VCC seraient le résultat d'une LAP abortive en réponse à la restriction imposée par BST2. L'objectif de ma thèse est donc de caractériser les mécanismes moléculaires aboutissant à la séquestration du VIH-1 dans les VCC dans les macrophages humains. Pour cela, j'ai mené deux axes de recherche : i) définir le rôle de BST2 dans la formation des VCC, ii) étudier l'implication de la LAP dans la séquestration du VIH-1 dans les macrophages. Les données obtenues sur l'axe 1 indiquent que Vpu est capable d'augmenter le relâchement de particules virales ainsi que de contrôler le volume des VCC dans les macrophages. Ce phénotype dépend de l'expression de BST2. En effet, Vpu diminue l'expression cellulaire et de surface de BST2, et exclut BST2 des VCC. Cette plus faible présence de BST2 en surface et dans les VCC favorise la dissémination du virus et réduit la quantité de virus séquestrés dans ces compartiments et, de facto, le volume des VCC. Ces activités de Vpu dépendent en partie de l'intégrité de son domaine transmembranaire et des motifs di-sérine S52-S56 et E59xxxLV64. Par ailleurs, notre étude révèle que les VCC sont toujours présents dans les macrophages en l'absence de BST2, réfutant l'hypothèse selon laquelle BST2 serait indispensable à la formation de ces compartiments. Cette première partie montre que Vpu et BST2 sont deux acteurs antagonistes, cellulaires et viraux, contrôlant le volume des VCC dans les macrophages. Dans le second axe de recherche, nous avons évalué la contribution du mécanisme de LAP-like engagé par Vpu dans la séquestration virale. Nos données montrent que les protéines LC3B, LC3C et ATG5, sont recrutées sur les membranes des LAPosomes dans un contexte non infectieux et sont enrichies sur les VCC lors de l'infection par le VIH-1. Nos résultats préliminaires suggèrent un rôle de ces acteurs de l'autophagie dans la séquestration des virus dans les macrophages humains. Des études sont en cours au laboratoire pour déterminer la contribution exacte de ces protéines ATG dans la formation et la persistance de ces sanctuaires viraux.

Human Immunodeficiency Virus, HIV-1, currently infects 37.9 million of people across the world, counting 32 million of deaths since the beginning of the epidemic. One of the major issues is to purge viral reservoirs, obstacles to complete cure of patients. Those reservoirs are majorly constituted of latently infected CD4 T cells in which the expression of the viral genome is repressed. Macrophages have also been shown to be viral sanctuaries, capable of archiving fully infectious viruses in intracellular vesicles (VCC) for long periods, even in patients on antiretroviral therapy. VCC are pH neutral structures derived from invaginated membranes. They are enriched in tetraspanins CD81, CD63, CD53, CD36, CD9, HLA-DR, Siglec1 but also in BST2/Tetherin. BST2 is a restriction factor of HIV-1, able to physically tether budding viruses at the membrane impeding their dissemination. Facing this restriction, HIV-1 has evolved, and its viral protein Vpu counteracts BST2 restriction. Indeed, Vpu alters BST2 trafficking, diminishes its cell surface expression by targeting it to lysosomal degradation. Moreover, HIV-1 can engage a non-canonical autophagy process, similar to LC3-associated phagocytosis (LAP) to antagonise BST2. In this process, Vpu binds to LC3C and triggers a LAP-like process leading to surface BST2 sequestration in internal vesicles, decorated by LC3 molecules. Interestingly, we observed that silencing of LC3C in HeLa cells led to virions sequestration into single membrane vesicle very similar to the VCC found in infected macrophages. This observation led us to hypothesise that VCC would be the result of an abortive LAP process. Therefore, my thesis objectives are to characterise molecular mechanisms leading to HIV-1 sequestration in VCC in macrophages. To do so, I addressed two issues: i) define BST2 contribution to VCC formation, ii) monitor the implication of the LAP process in HIV-1 sequestration in VCC. First, we show that Vpu is able to increase viral release and to control VCC volume. These effects of Vpu depends on BST2 expression. Indeed, Vpu decreases BST2 expression, both at cellular and cell surface levels, and excludes BST2 from VCC. This limited amount of BST2 at the cell surface and in VCC favors viral dissemination and reduces the quantity of viruses trapped into VCC, reducing by the way VCC volume. Those Vpu activities rely on the integrity of its transmembrane domain, and on its di-serine S52-S56 and E59xxxLV64 motifs. Furthermore, our study reveals that BST2 silencing does not prevent the formation of VCC, refuting the hypothesis of BST2 being necessary to VCC formation. This first part highlights that BST2 and Vpu act as two antagonist factors, in the control of VCC volume in macrophages. In the second part of my thesis, we evaluated the contribution of Vpu-induced LAP-like pathway to viral sequestration in macrophages. Our data show that LC3B, LC3C and ATG5 proteins are recruited onto the LAPosomes membranes in non-infectious condition, and also enriched on VCC in infected macrophages. Moreover, our preliminary results suggest a role for those autophagy proteins in viral sequestration in human macrophages. Further studies are ongoing in the lab to determine the exact contribution of these ATG proteins in the formation and persistence of these HIV sanctuaries.