Rôle de la phagocytose des globules rouges surchargés en sphingolipides dans la physiopathologie de la maladie de Gaucher

Role of the phagocytosis of sphingolipid overloaded red blood cells in Gaucher disease pathophysiology

• Auteur / Autrice : Lucie Dupuis
• Direction : Mélanie Franco
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie et physiopathologie
• Date : Soutenance le 30/09/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie intégrée du globule rouge (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Loïc Garçon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Loïc Garçon, Thierry Levade, Marc Gabriel Berger
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Loïc Garçon, Thierry Levade

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sphingolipides

Phagocytose

Érythrocytes

Gaucher, Maladie de

Mots clés libres

Maladie de Gaucher

Globule rouge

Macrophage

Erythrophagocytose

Sphingolipides

Erythropoièse

Anémie

Gaucher disease

Red blood cell

Macrophage

Erythrophagocytosis

Sphingolopid

Erythropoiesis

Anemia

Résumé

La Maladie de Gaucher est une maladie génétique rare caractérisée par une déficience enzymatique de la ß-glucocérébrosidase (GCase), conduisant à une accumulation de sphingolipides (SL) dans les macrophages appelés alors Cellules de Gaucher. Il a été reporté que les macrophages issus de patients Gaucher présentent certains marqueurs de surface et sécrètent des cytokines spécifiques. Ces macrophages sont communément tenus comme premiers responsables des symptômes de la maladie, en infiltrant les tissus (foie, rate) ce qui provoquerait des atteintes hématologiques, une splénomégalie, des atteintes osseuses ainsi que la survenue d'évènements ischémiques dans la rate et les os. Toutefois, depuis quelques années, certaines équipes s'intéressent à d'autres types cellulaires pouvant être impactés par cette déficience en GCase. Ces autres types cellulaires pourraient être impliqués dans la physiopathologie de la maladie et devenir des cibles thérapeutiques intéressantes. Certains symptômes de la maladie de Gaucher comme l'anémie modérée, la splénomégalie et les vaso-occlusions, indiquent que la lignée érythrocytaire pourrait être également impliquée dans la physiopathologie de la maladie. Notre laboratoire a mis en évidence des anomalies morphologiques, rhéologiques et d'adhérence des globules rouges (GRs), ainsi qu'une accumulation de différents SL dans ces cellules. Ces anomalies pourraient souligner le rôle essentiel des GRs dans la physiopathologie de la maladie. En effet, en plus d'une contribution dans la survenue d'évènements vaso-occlusifs, ces GRs anormaux pourraient être retenus dans la rate ou la moelle osseuse et être phagocytés par les macrophages. La rétention de ces GRs pourrait en partie expliquer l'anémie chez les patients. En outre, une demi-vie alterée des GRs aurait été rapportée, et de nombreux évènements d'érythrophagocytose par les cellules de Gaucher dans la moelle osseuse de patients ont été répertoriés. Tous ces éléments nous ont conduits à étudier durant mon travail de thèse, l'érythrophagocytose des GRs dans le contexte pathologique de maladie de Gaucher. Dans un premier temps, nous avons développé des tests d'érythrophagocytose in vitro à partir de macrophages dérivés de la lignée monocytaire THP-1. Nous avons mis en évidence une phagocytose importante des GRs issus de patients Gaucher, corrélée à leurs propriétés morphologiques anormales, leur déformabilité réduite et leur surcharge en SL. Nous avons également mis en évidence un effet du traitement par remplacement enzymatique sur l'érythrophagocytose. Des tests à partir de macrophages primaires dérivés de monocytes ont confirmé ces résultats dans un contexte plus physiologiques. Enfin, nous avons démontré un effet de l'érythrophagocytose de GRs Gaucher sur le phénotype des macrophages (augmentation de l'expression de certains marqueurs connus pour être élevés dans les macrophages Gaucher). Dans un second temps, nous avons étudié l'effet de la surcharge en SL sur les propriétés des GRs Gaucher. Nous avons observé que cette surcharge corrèle avec les propriétés anormales des GRs dont leur phagocytose. Afin de déterminer l'origine de la surcharge en SL dans les GRs Gaucher nous avons aussi réalisé des expériences in vitro de surcharge en lipides et d'érythropoïèse qui nous ont permis de mettre en évidence 1/ une incorporation passive des SL entre le compartiment plasmatique et les GRs 2/ une accumulation en SL au cours de l'érythropoïèse. L'ensemble de nos résultats démontrent le rôle essentiel des GRs dans la physiopathologie de la maladie de Gaucher, en mettant en évidence une érythrophagocytose anormale par les macrophages. Celle-ci pourrait contribuer aux modifications phénotypiques des macrophages conduisant à la formation des cellules de Gaucher. Enfin, nous avons mis en évidence le lien direct entre la surcharge en SL dans les GRs et leurs propriétés altérées.

Gaucher disease is a lysosomal storage disorder caused by glucocerebrosidase (GCase) deficiency, leading to an accumulation of sphingolipids (SL) in macrophages, named Gaucher Cells. It has been reported that macrophages from Gaucher patients have certain surface markers and secrete specific cytokines. These macrophages are commonly considered as the culprits of the pathophysiology of Gaucher disease, infiltrating tissues (liver, spleen, bone marrow) and resulting in hematologic manifestations (anemia, thrombocytopenia), splenomegaly, and ischemic events in the spleen and bones. However, certain studies highlight the role of other types of cell affected by a GCase deficiency which seems to be involved in the pathophysiology of the disease and could therefore become interesting therapeutic targets. Some symptoms of the disease as anemia, splenomegaly and vaso-occlusive events suggest that the erythroid lineage could also be involved in the disease. Our team has already demonstrated that red blood cells (RBCs) from Gaucher patients exhibited abnormal morphologies, altered rheological, aggregation and adhesion properties, and exhibited also SL overload that reduces RBCs' deformability. These morphological and functional abnormalities highlight the role of RBCs in the pathophysiology of the disease. Indeed, in addition to a contribution in the occurrence of vaso-occlusive events, these abnormal RBCs could be retained in the spleen or the bone marrow and be phagocytosed by macrophages. The retention of these RBCs could partly explain anemia in patients. In addition, an altered half-life of RBCs as well as numerous events of erythrophagocytosis by Gaucher cells in the bone marrow of patients have been reported. All these elements led us to study during my thesis work, erythrophagocytosis of RBCs in the pathological context of Gaucher disease. In the first part, we conducted In vitro experiments of erythrophagocytosis using the monocytic THP-1 cell line differentiated in macrophages. Our results showed significant increases of the erythrophagocytosis process of Gaucher RBCs compared to healthy RBCs. We established strong correlations between the erythrophagocytosis rate and their abnormal morphologies, reduced deformability and their SL overload. We also highlighted an effect of the enzyme replacement therapy on the erythrophagocytosis rate. In addition, some in vitro experiments using primary macrophages derived from healthy monocytes have confirmed our results in a more physiological context. Finally, we have demonstrated an effect of the erythrophagocytosis of Gaucher RBCs on the macrophages' phenotype, with the induction of Gaucher Cell markers (increased expression of certain surface markers and secretion of cytokines known to be elevated in Gaucher macrophages). Second, we studied the effect of SL overload on the properties of Gaucher RBCs. We observed that the SL overload correlates with the abnormal RBCs properties including their phagocytosis. In order to determine the origin of SL overload in Gaucher RBCs we also carried out in vitro experiments of lipid overload and erythropoiesis which allowed us to highlight 1/ passive incorporation of SL between the plasma compartment and RBCs 2/ an accumulation in SL during the erythropoiesis. All of our results demonstrate the essential role of RBCs in the pathophysiology of Gaucher disease, by highlighting an abnormal erythrophagocytosis by macrophages. This increased erythrophagocytosis could contribute to phenotypic changes in macrophages leading to the formation of Gaucher cells. Finally, we have highlighted the direct link between the SL overload in RBCs and their altered properties. We emphasize in particular that SL overload in mature RBCs can be established as early as erythropoiesis.