Biomarqueurs innovants du rejet en allogreffe rénale : transfert de la recherche à l'utilisation clinique et apports physiopathologiques

Translational research in innovative biomarkers in kidney allograft rejection : allowing transfer of clinical research to clinical practice and providing new insights to basic science

• Auteur / Autrice : Claire Tinel
• Direction : Dany Anglicheau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 28/09/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Necker Enfants-Malades (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Christophe Legendre
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Legendre, Pierre Galichon, Oriol Bestard, Sophie Brouard, Pierre Marquet, Maarten Naesens, Sophie Caillard
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pierre Galichon, Oriol Bestard

Mots clés

Mots clés contrôlés

MicroARN

Chimiokines

Marqueurs biologiques

Rein -- Transplantation

Mots clés libres

Transplantation rénale

Rejet aigu

Biomarqueurs

Chimiokines urinaires

MicroARN

Modèle multiparamétrique

Kidney transplantation

Acute rejection

Biomarkers

Urinary chemokines

MicroRNA

Multiparametric model

Résumé

Les avancées technologiques ont permis l'avènement de biomarqueurs innovants pour l'évaluation des lésions du greffon rénal. Toutefois, notre raisonnement médical pour décider d'une biopsie repose toujours sur des données biologiques conventionnelles peu performantes. Au cours de ce travail de thèse, nous avons émis l'hypothèse que le préalable au transfert des biomarqueurs de la recherche vers la clinique était la robustesse de la sélection des candidats puis leur intégration dans des modèles multiparamétriques validés montrant un bénéfice clinique net. Certains biomarqueurs étant des acteurs de la réponse immunitaire alloimmune, nous avons postulé que la découverte de signatures moléculaires diagnostiques du rejet pouvait apporter de nouvelles hypothèses physiopathologiques. Dans un premier travail, nous avons optimisé l'utilisation des chimiokines urinaires CXCL9 et CXCL10 pour le diagnostic non-invasif du rejet aigu. L'expression de ces cytokines chimiotactiques est augmentée dans les urines des patients au cours du rejet aigu, mais également lors des infections urinaires (IU) ou de la réplication du BK virus (BKV) pouvant constituer des facteurs de confusion. Nous avons mesuré les protéines CXCL9 et CXCL10 dans 391 échantillons urinaires, prélevés concomitamment d'une biopsie du greffon, d'un examen cytobactériologique des urines et d'une charge virale sanguine du BK virus. Les concentrations urinaires de CXCL9 et CXCL10 étaient augmentées en cas d'IU, de même qu'en cas virémie à BKV, associée ou non à une néphrite virale (P<0.001). Les chimiokines urinaires et leurs facteurs de confusion ont ensuite été inclus dans un modèle comportant 8 variables (âge et sexe du receveur, débit de filtration glomérulaire, anticorps anti-HLA spécifiques du donneur [DSAs, donor specific antibodies], IU, charge virale sanguine du BKV, CXCL9 et CXCL10), discriminant le rejet aigu avec une aire sous la courbe (AUC, area under the curve) de 0.85 (IC 95% : 0.80-0.89). Après validation interne (calibration, analyse de sensibilité) et externe dans 2 cohortes indépendantes, une analyse de courbe de décision a été réalisée montrant le bénéfice clinique du modèle. Dans un deuxième travail, nous avons quantifié l'expression sanguine de microARN (miARN) qui ont pour fonction la régulation post-transcriptionnelle de l'expression des ARN messages (ARNm). Dans le cadre de l'étude européenne BIOMARGIN, 754 miARN candidats ont été quantifiés dans 126 échantillons (Step 1). Les 141 miARN les plus performants ont été quantifiés dans les 136 échantillons de la seconde cohorte cas-témoins (Step 2) pour développer une signature diagnostique du rejet aigu humoral (RAH) associant 3 miARN (miR-15b, miR-106a, miR-374a). Ses performances ont été validées sur une cohorte prospective non sélectionnée (Step 3, n=444 échantillons, AUC=0.70). Puis la signature miARN a été combinée à la protéinurie et aux DSAs pour obtenir un modèle de diagnostic du RAH avec une AUC à 0,85 (IC 95% : 078-0.93, P<0.0001). L'expression des 3 miARN était diminuée en cas de RAH suggérant une augmentation des gènes cibles de leur régulation. Nous avons montré que 24% des gènes fortement augmentés en cas de RAH (transcriptomique sanguine globale issue de la Step 1) étaient régulés par 1 des 3 miARN. L'analyse in silico suggérant un enrichissement dans les voies de signalisation associées aux cellules myéloïdes, nous avons confirmé in vitro que les 3 miARN étaient principalement exprimés par les monocytes classiques. Ce travail a permis de définir les facteurs confusion à l'utilisation des chimiokines urinaires pour le diagnostic non invasive du rejet aigu, et de démontrer pour la première fois comment leur intégration dans un modèle multiparamétrique pourrait permettre leur adoption en clinique. De plus, l'identification d'une signature miARN d'origine monocytaire au cours du RAH, suggère leur implication physiopathologique au-delà de leur potentiel comme biomarqueurs.

With the development of many innovative tools, transplant medicine is slowly entering the era of precision medicine. Still, the current clinical routine in kidney transplantation uses traditional markers. During this thesis work, we hypothesized that translation from exploratory studies to clinical practice would require a thorough validation of candidate biomarkers, their integration into multiparametric models and the demonstration of their clinical utility. Besides, as biomarkers can also be key-players in alloimmune injury, we speculated that research could shed the light on new pathways involved in allograft rejection. In a first research work, we addressed the transfer of urinary chemokines CXCL9 and CXCL10 from research to clinical practice. These chemoattractant cytokines are promising noninvasive markers of acute rejection (AR) in kidney recipients but their levels might be confounded by urinary tract infection (UTI) and BK-virus reactivation. Here, we specifically addressed these confounding factors to develop and validate multiparametric models in a training set of 391 samples to optimize the diagnostic performance of urinary chemokines. CXCL9 and CXCL10 increased in UTI and BKV viremia with or without nephropathy (P<0.001). An optimized 8-parameter model (recipient age, sex, eGFR, DSAs [donor specific antibodies], UTI, BKV blood viral load, CXCL9 and CXCL10) diagnosed AR with high accuracy (AUC: 0.85, 95% CI: 0.80-0.89). This model remained highly accurate at the time of screening (AUC: 0.81, 95% CI: 0.48-1) or indication biopsies (AUC: 0.85, 95% CI: 0.81-0.90) and within the first year (AUC: 0.86, 95% CI: 0.80-0.91) or later (AUC: 0.90, 95% CI: 0.84-0.96). These 8 parameters diagnosed AR with an AUC of 0.85 and 0.92 (P<0.0001) in two external validation cohorts. Considering confounding factors rather than excluding them, we optimized a noninvasive multiparametric diagnostic model for AR of kidney allografts, and confirmed its clinical utility in a decision curve analysis. In a second research work, we investigated blood miRNAs as non-invasive biomarkers in kidney transplantation as part of the BIOMARGIN consortium (Biomarkers of Renal Graft Injuries in kidney allograft recipients). MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs which regulate mRNA expression at the posttranscriptional level. Blood samples were collected at time of the 706 renal allograft biopsies, in four European transplant centers. Both mRNAs and miRNAs were quantified in a multistage discovery-to-validation study. Primary end point was the diagnostic accuracy of a multiple miRNAs biomarker for antibody-mediated rejection (ABMR), assessed in 444 unselected and consecutively collected samples. We identified a 3-miRNA signature (miR-15b, miR-106a, miR-374a) which yielded an AUC of 704% for the diagnosis of ABMR. Combined with proteinuria and donor-specific antibodies, the model yielded an AUC of 85.3% (95% CI, 77.9 to 92.8; p<0.0001). The expression of the 3 miRNAs was significantly decreased in ABMR patients suggesting an increased expression of their targeted mRNAs. Intersection of these targeted genes with the whole transcriptome data showed indeed that up to 24% of the highly up-regulated mRNAs (fold-change >1) in ABMR cases, were regulated by one of the 3 miRNAs. In silico analyses suggested an enrichment in myeloid-derived pathways, and among PBMC subsets, the 3 miRNAs were confirmed to be mainly originating from classical monocytes. This research work identified the confusion factors in using urinary chemokines as non-invasive markers of acute rejection, and as a first we built a multiparametric well-validated model which proved its clinical utility. Moreover, our data provide new insights in miRNAs as biomarkers as well as key-player in ABMR. The link between monocytes response in the blood and their infiltrating properties in the allograft could provide new insights to pathological mechanisms in ABMR.