Microfluidique en gouttelettes à haut débit pour l'identification des répertoires d'anticorps des cellules B mémoires et des plasmocytes

Single-cell characterization of auto reactive IgG-secreting cells in Immune thrombocytopenia patients

• Auteur / Autrice : Pablo Canales Herrerías
• Direction : Pierre Bruhns, Jean Baudry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunité et infection
• Date : Soutenance le 24/09/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Anticorps en Thérapie et Pathologie
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département d'Immunologie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Andreas Radbruch
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : David Boutboul, Marion Espéli
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Ziv Shulman, Thierry Defrance

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maladies autoimmunes

Plasmocytes

Lymphocytes B

immunologie

Anticorps

Microfluidique

Mots clés libres

Anticorps

Microfluidique

Single-cell

Auto-immunité

Antibody

Microfluidics

Single-cell

Autoimmunity

Résumé

Les anticorps sont des acteurs clés des réponses immunitaires protectrices en favorisant la destruction des agents pathogènes et en conférant une mémoire immunologique, obtenue grâce à leur production à long terme par les plasmocytes. Cependant, les réponses anticorps peuvent également être néfastes, en particulier dans le contexte de maladies auto-immunes, où les protéines endogènes peuvent être ciblées par des autoanticorps. La thrombopénie immunitaire (PTI) est un trouble immunitaire caractérisé par une forte réponse auto-immune contre les antigènes plaquettaires, ce qui entraîne une diminution des taux de plaquettes. Les manifestations cliniques se présentent souvent sous forme de saignements légers sur la peau ou les surfaces muqueuses, mais peuvent également inclure des épisodes de saignement interne potentiellement mortels dans les cas plus graves. Bien que les anticorps soient connus pour être au cœur de cette pathologie, la population de plasmocytes autoréactifs reste mal caractérisée, notamment en termes d'affinité de leurs anticorps et des sites anatomiques dans lesquels ils résident. L'étude de cellules plasmatiques spécifiques est souvent difficile en raison de l'absence de lien physique entre une cellule et son anticorps sécrété. Dans cette thèse, j'ai développé une nouvelle plateforme microfluidique qui permet de caractériser des plasmocytes isolés de tissus humains, en termes de sécrétion d'anticorps et d'affinité pour l'autoantigène plaquettaire GPIIbIIIa. Les cellules sont encapsulées dans des gouttelettes microfluidiques (de l'ordre du picolitre) dans lesquelles toutes les protéines sécrétées resteront piégées, et un test biologique basé sur la fluorescence est utilisé pour détecter la sécrétion d'anticorps et la liaison à l'antigène. À l'aide de cette plateforme, j'ai analysé les cellules de 24 patients PTI et 12 donneurs sains, et comparé la fréquence des plasmocytes autoréactifs dans différents sites anatomiques, à savoir la rate, la moelle osseuse et le sang (dans certains cas prélevés sur le même individu). De manière remarquable, j'ai trouvé que les plasmocytes autoréactifs avec une forte affinité pour GPIIbIIIa peuvent être présents dans les trois sites anatomiques étudiés, y compris la moelle osseuse, un site qui pourrait leur assurer une survie à long terme. De plus, j'ai trouvé une corrélation en termes d'ampleur de la réponse localisée dans différents organes des mêmes patients, reflétant peut-être un processus d'expansion de la réponse. Ces résultats nous aideront à comprendre la pathogenèse sous-jacente du PTI et mettent déjà en évidence les possibilités uniques que les technologies microfluidiques en gouttelettes peuvent offrir dans l'étude des réponses anticorps.

Antibodies are key players in protective immune responses by promoting the destruction of pathogens and conferring immunological memory, which is achieved through their long-term production by plasma cells. However, antibody responses can also be detrimental, particularly in the context of autoimmune disorders, where host proteins can be targeted by autoantibodies. Immune Thrombocytopenia (ITP) is an immune disorder characterized by a strong autoimmune response against platelet antigens, which causes platelet levels to be diminished. Clinical manifestations often present as mild bleeding on the skin or mucosal surfaces, but can also include life-threatening internal bleeding episodes in more severe cases. Although antibodies are known to be central to this pathology, the autoreactive plasma cell population has remained poorly characterized, especially in terms of the affinity of their antibodies and the anatomical locations where they reside. The study of specific plasma cells is often challenging due to the lack of a physical link between a cell and its secreted antibody. In this thesis, I developed a novel microfluidic platform that allows for the characterization of single plasma cells isolated from human tissues, in terms of antibody secretion and affinity for the autoantigen GPIIbIIIa. Cells are encapsulated in picoliter droplets where any secreted proteins will remain trapped, and a fluorescence-based bioassay is used to detect antibody secretion and antigen binding. Using this platform, I analyzed cells from 24 ITP patients and 12 healthy donors, and compared the frequency of autoreactive plasma cells in different anatomical sites, namely spleen, bone marrow and blood (in some cases taken from the same individual). Remarkably, I found that autoreactive plasma cells with high affinity for GPIIbIIIa can be present in all anatomical locations, including the bone marrow, a site that could grant them long-term survival. Furthermore, I found a correlation in terms of the magnitude of the response located in different organs of the same patients, probably reflecting a process of expansion of the response. These results will aid our understanding of the underlying pathogenesis of ITP, and highlight the unique possibilities that droplet microfluidic technologies can offer in the study of antibody responses.