Caractérisation des mécanismes moléculaires de la persistance au triméthoprime chez Escherichia coli

Characterization of the molecular mechanisms of the persistence to trimethoprim in Escherichia coli

• Auteur / Autrice : Wei Lin Su
• Direction : Ivan Matic
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 18/06/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cochin (Paris ; 2002-....)
• Jury : Président / Présidente : Erick Denamur
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Erick Denamur, Laurence Van Melderen, Didier Mazel, Jean-Marc Ghigo, Pablo Radicella
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Laurence Van Melderen, Didier Mazel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Réponse SOS (génétique)

Triméthoprime

Escherichia coli

Mots clés libres

Triméthoprime

Escherichia coli

Mort cellulaire

Persistance

Toxine-antitoxine

TisB

Force protomotrice

Transport actif

Trimethoprim

Escherichia coli

Cell death

Persistence

SOS response

Toxinantitoxin

TisB

Proton motive force

Active transport

Résumé

Le triméthoprime (TMP) est un antibiotique à spectre large, ayant une activité antibactérienne, antifongique et antiparasitaire. Il est couramment utilisé seul ou en association avec le sulfaméthoxazole dans le traitement d'infections urinaires. Malgré une compréhension générale du mécanisme d'action du TMP, très peu d'études s'intéressent aux réponses induites chez la bactérie par cet antibiotique. Pour étudier l'impact du TMP chez Escherichia coli, nous avons utilisé différents outils génomiques et génétiques. Nous avons ainsi pu comparer les effets de concentrations sub-létales aux effets des concentrations létales de TMP et mis en évidence que certaines réponses au stress, telles que la réponse SOS, la réponse médiée par RpoS ou la réponse aux ERO (espèces réactives de l'oxygène), pouvaient jouer des rôles différents en fonction de la concentration de TMP. En se focalisant sur les effets des concentrations létales, nous avons pu préciser le mode d'action bactéricide du TMP et caractériser les bactéries exposées au TMP. Nous avons notamment montré que le TMP tuait significativement moins de bactéries que d'autres antibiotiques bactéricides, tels que l'ampicilline et la ciprofloxacine et que l'effet bactéricide du TMP sur E. coli était retardé, comparé à ces mêmes antibiotiques. Afin de distinguer les bactéries tuées par le TMP des bactéries qui y ont survécu - les cellules persisters - nous avons étudié les populations traitées par TMP. Cela a permis de mettre en évidence : i) une importante hétérogénéité des bactéries traitées sur le plan morphologique, les cellules persisters sont des cellules de petite taille, ii) la dégradation de l'ADN chez la majorité des bactéries traitées, iii) la perméabilisation de la membrane cellulaire suite au traitement par TMP, iv) la survenue de la mort cellulaire durant la phase de récupération post traitement. Ces résultats nous permettent de caractériser les cellules persistantes au TMP et de mieux comprendre l'activité du TMP. Par son mécanisme d'action le TMP affecte la synthèse d'ADN, induit la réponse SOS suite aux dommages à l'ADN. Nous avons mis en évidence que l'induction de la réponse SOS joue un rôle dans la mort des bactéries traitées par des concentrations létales de TMP. L'étude de différents gènes contrôlés par le régulon SOS montre en particulier l'implication du système toxine-antitoxine TisB/IstR. L'expression de la toxine TisB entraine la perte du potentiel de membrane perturbant ainsi les fonctions associées à la membrane qui dépendent de la force protomotrice. Nous montrons que l'expression de TisB entraîne en effet, une chute des quantités d'ATP intracellulaire et un défaut de l'import de molécules via des transporteurs actifs dépendants de la force protomotrice. Le blocage de ces transporteurs peut être délétère s'il empêche l'importation de molécules nécessaires à la survie. L'import de thymine dépend du gradient de protons, et dans le cas du traitement par TMP, la thymine peut protéger la cellule en diminuant l'impact du TMP sur la synthèse d'ADN. En présence de TisB, la thymine ne peut donc pas être importée et atténuer les effets du TMP. Cependant, le blocage de ces transporteurs peut également protéger les cellules en empêchant l'entrée de certaines molécules toxiques, c'est ce que suggèrent nos résultats préliminaires avec des antibiotiques de la classe des aminoglycosides. Nos résultats suggèrent que l'impact de TisB dépend du stress rencontré et de la composition du milieu extracellulaire. La fonction biologique de TisB semble être plus complexe que le simple rôle de facteur favorisant la persistance, initialement énoncé. Cela ouvre des perspectives dans la compréhension de la réponse SOS, du rôle de la toxine TisB dans l'évolution et l'adaptation d'E. coli dans divers environnements.

Trimethoprim (TMP) is a broad-spectrum antibiotic that is active against bacteria, fungi or parasites. It is commonly used alone or in association with sulfamethoxazole to treat urinary tract infections. Despite a general understanding of TMP's mode of action, only few studies investigated the responses induced in bacteria by this antibiotic. To study the impact of TMP on Escherichia coli, we used different genomic and genetic tools. We compared the impact of sublethal and lethal concentrations of TMP and showed that some stress-induced responses, such as SOS, RpoS mediated response or response to ROS, have different roles depending on the concentration of TMP used. Then, we focused on the impact of lethal concentrations of TMP, which allowed us to improve our understanding of the bactericidal activity of TMP and to characterize the responses of bacteria exposed to TMP. In particular, we showed that TMP killed significantly less bacteria than other bactericidal antibiotics, such as ampicillin or ciprofloxacin, and that the bactericidal effect of TMP on E. coli was delayed as compared to these antibiotics. In order to distinguish the bacteria killed by TMP from the bacteria that survived to TMP - the persister cells - we studied the TMP-treated population. We found that: i) there is a significant heterogeneity in the treated bacteria in terms of morphology, and that persisters are small cells, ii) DNA is damaged in most of the treated bacteria, iii) the cell membrane is permeabilized following the TMP treatment, iv) cell death also occurs during recovery. These results enabled us to characterize the persisters to TMP and to better understand the activity of TMP. Through its mode of action, TMP impairs DNA synthesis and induces the SOS response as a result of DNA damages. We showed that the induction of the SOS response plays a part in TMP-induced cell death. The investigation of different genes of the SOS regulon showed in particular, the involvement of the TisB/IstR toxin-antitoxin system. The expression of TisB causes membrane depolarization, thus disrupting membrane-associated functions that depend on the proton motive force (PMF). We showed that the expression of TisB indeed caused a drop in intracellular ATP levels and a defect in the import of molecules by PMF dependent transporters. The blockage of these transporters can be deleterious if it prevents the importation of molecules necessary to survival. The import of thymine depends on the PMF, and in the case of TMP treatment, thymine can protect the cell by diminishing the impact of TMP on DNA synthesis. Therefore, in presence of TisB, thymine cannot be imported and alleviate the effect of TMP. Yet, the blockage of the transporters can also protect the cells by preventing the entry of some toxic molecules, as our preliminary results suggest so for aminoglycoside antibiotics. Our results suggest that the impact of TisB depends on the stress encountered and the composition of the extracellular medium. The biological function of TisB seems to be more complex than the initially stated role that is to favor the formation of persister cells. This opens interesting perspectives in the understanding of the SOS response, of TisB role in the evolution and adaptation of E. coli in various environments.