Rôles de HELLS dans la méthylation de l'ADN et la réponse immune humorale dans un modèle murin du syndrome ICF (Immunodéficit, instabilité Centromérique, et anomalies Faciales)

Roles of HELLS in DNA methylation and humoral immune response in a murine model in ICF syndrome (Immunodeficiency, Centromeric instability, and Facial anomalies)

• Auteur / Autrice : Éléonore Mulot
• Direction : Sébastien Storck
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 28/05/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Necker Enfants-Malades (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Michèle Goodhardt
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michèle Goodhardt, Olivier Bernard, Ahmed Amine Khamlichi, Céline Delaloy
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Olivier Bernard, Ahmed Amine Khamlichi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lymphocytes B

Méthylation

Réponse immunitaire

Mots clés libres

Syndrome ICF

Immunodéficience

Lsh

Centre Germinatif

Lymphocytes B mémoires

Méthylation de l'ADN

Séquences satellites répétées

ICF syndrome

Immunodeficiency

Lsh

Germinal center

Memory B lymphocytes

DNA methylation

Satellite repeats

Résumé

Le syndrome ICF (Immunodéficit, instabilité Centromérique, et anomalies Faciales) est une maladie monogénique autosomique récessive rare. Les patients ICF présentent un retard mental et un déficit de croissance plus ou moins marqués, avec des anomalies faciales modérées. Ils sont tous sujets à des infections répétées, notamment respiratoires et gastro-intestinales, et ne répondent pas à la vaccination en raison d'un défaut de l'immunité humorale : ils ont une hypogammaglobulinémie et un très faible nombre de lymphocytes B mémoires (MBCs) ce qui suggère un défaut de maturation tardive des lymphocytes B (LB). Ceci est parfois couplé à une réduction du nombre de lymphocytes T qui provoque des infections opportunistes chez certains patients. En dehors de l'immunodéficience, ce qui caractérise le syndrome ICF est le défaut moléculaire qui permet de faire le diagnostic de la maladie. Le caryotype de lymphocytes stimulés de patients ICF met en évidence des anomalies chromosomiques telles que des délétions de bras chromosomiques, des translocations, ou encore des fusions de centromères aboutissant à des chromosomes multi-branchés. Cela est lié à une décondensation de la chromatine qui fait suite à une hypo-méthylation de l'ADN au niveau des régions satellites répétées péri-centromériques des chromosomes 1, 9 et 16. A ce jour, quatre gènes ont été découverts pour expliquer l'origine génétique de la maladie, mais il reste encore une faible proportion de patients dont le gène n'est pas connu (ICFX). Chaque patient porte des mutations perte de fonction dans un de ces quatre gènes qui semblent tous participer à la voie de la méthylation de l'ADN : DNMT3B (ICF1) est une ADN méthyl-transférase de novo, ZBTB24 (ICF2) est un facteur de transcription et CDCA7 (ICF3) avec LSH (ICF4) forment un complexe de remodelage de la chromatine. L'objectif de ma thèse est de déterminer l'origine cellulaire du défaut immunitaire humoral des patients ICF. Pour cela, nous avons créé un modèle murin du syndrome ICF, qui consiste en un knock-out conditionnel du gène Lsh (LshcKO) dans les LB (mb1-Cre, progéniteur B). Nous avons montré que LSH est impliqué dans le maintien de la méthylation de l'ADN au niveau de séquences répétées dans les LB, et que sa délétion conduit à la réactivation de rétrovirus endogènes et de séquences satellites mineures au niveau des centromères dans les LB du centre germinatif (GC B). Cependant, la perte de fonction de LSH ne provoque pas de blocage du développement B dans la moelle osseuse, et ne semble pas conduire à un défaut de prolifération, de commutation de classe vers IgG1 ou de différenciation en cellules sécrétrices d'anticorps in vitro. En revanche, les souris LshcKO présentent un défaut de réponse humorale à un antigène T-dépendant (NP-CGG) : le taux et l'affinité de leurs anticorps IgG1 sont très diminués après un rappel antigénique. Cela peut s'expliquer par une chute prématurée de GC observée deux semaines après l'immunisation primaire, qui pourrait être à l'origine de la diminution de MBCs spécifiques de l'antigène que l'on retrouve à un mois de distance. Par ailleurs, la réponse extrafolliculaire IgM est très affectée tout comme la réponse T-indépendante au NP-Ficoll de ces animaux. Ces deux derniers résultats suggèrent un défaut immunitaire plus large et complexe qu'attendu. Pour conclure, nous avons établi le premier modèle murin qui reproduit une partie du phénotype immunitaire du syndrome ICF, à savoir une mémoire humorale réduite. Ce phénotype est certainement intrinsèque aux cellules B, car nous avons observé le même résultat en supprimant le gène Lsh dans les LB matures (CD21-Cre), et provient probablement d'un défaut de maintien du GC. Ce modèle murin sera utile pour l'identification de cibles potentielles dont l'hypo-méthylation pourrait résulter en un dysfonctionnement des LB.

ICF syndrome (Immunodeficiency, Centromeric instability, and Facial anomalies) is a rare autosomal recessive disease which is monogenic. ICF patients display a variable severity of mental retardation and growth deficiency, with moderate facial anomalies.They all catch most frequently respiratory and gastro-intestinal recurrent infections, due to their immune phenotype : they have a hypo or even agammaglobulinemia, a very low number of memory B lymphocytes (MBCs) and they are not able to respond to vaccination. This suggests a defect of late differentiation of B lymphocytes. Some patients suffer from additional opportunistic infections as a consequence of a reduction of the number of T lymphocytes. Apart from the immunodeficiency, ICF syndrome is characterized by a pathognomonic molecular defect : the karyotype of in vitro stimulated ICF lymphocytes shows chromosomal anomalies such as chromosomal arms deletions, translocations, or centromeric fusions leading to multiradial figures. This is due to chromatin decondensation consecutive to DNA hypomethylation at satellite repeats of the pericentromeric regions of chromosomes 1, 9 and 16. Up to now, four genes have been discovered to be responsible for the disease, but a small part of patients with unknown etiology still remains (ICFX). Each patient bears loss of function mutations in one of these four genes that all seem to be involved in the DNA methylation pathway : DNMT3B (ICF1) is a de novo DNA methyl-transferase, ZBTB24 (ICF2) is a transcription factor, and CDCA7 (ICF3) with LSH (ICF4) form a chromatin remodeling complex. The main goal of my thesis is to decipher the cellular origin of the humoral immune deficiency of ICF patients. For this, we have created a murine model of ICF syndrome, which consists in a conditional knock-out of Lsh gene (LshcKO) in B cell lineage (mb1Cre, progenitor B cell). We have shown that LSH is involved in the DNA methylation maintenance at several repeated sequences in B cells, and that its deletion leads to endogenous retroviruses and centromeric minor satellites reactivation in germinal center B cells (GC). However, loss of function of LSH does not impair the B cell development in the bone marrow and in vitro, LshcKO B cells have a normal ability to proliferate, isotype switch towards IgG1 and differentiate into antibody secreting cells. Nevertheless, LshcKO mice display a defective humoral response to a T dependent (TD) antigen (NP-CGG) : the titers and the affinity of their IgG1 antibodies are strongly diminished after a secondary antigenic challenge. This is likely explained by the premature collapse of GC observed at two weeks after primary immunisation, which could subsequently lead to a reduction of antigen-specific MBCs, found at 1-month distance. Besides, both the extrafollicular IgM response to TD antigen, and the T-independent response to NP-Ficoll are stongly affected in the mutant mice. These two latter results suggest a wider and more complex immune deficiency than expected. To conclude, we have established the first mouse model which reproduces partly the immune phenotype of ICF syndrome, such as a reduced humoral memory. This phenotype is most likely B cell intrinsic as we have observed the same result when we suppressed the Lsh gene in mature B cells (CD21-Cre), and it originates probably from a GC maintenance disruption. This murine model will be useful for the identification of putative targets whose hypomethylation could lead to a LB dysfunction.