Optimisation de la production de cGAMP-VLP et développement de cGAMP-VLP ciblées

cGAMP-VLP : optimization of production, functional studies, and development of a second generation

• Auteur / Autrice : Aurore Bochnakian
• Direction : Nicolas Manel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 16/12/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Immunité et cancer (Paris ; 2009)
• Partenaire(s) de recherche : Entreprise : Stimunity (2016-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Michel Sallenave
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Virginie Petrilli, Jab Rehwinkel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Produits chimiques -- Mise au point

Système immunitaire

Virus à ADN bicaténaire

Mots clés libres

CGAS

STING

CGAMP-VLP

Particules pseudo-virales

Réponse immunitaire

Immunothérapie

Injection intra-tumorale

Agoniste de STING

Développement de produit

CGAS

STING

CGAMP-VLP

Virus like particle

Immune response

Immunotherapy

Intra-tumoral injection

STING agonist

Product development

Résumé

L'ADN double brin chez les mammifères est présent exclusivement dans le noyau et les mitochondries. Sa présence dans le cytosol est un marqueur d'infection virale ou de stress cellulaire. L'ADN double brin est détecté dans le cytosol par l'enzyme cGAS, qui produit après activation le dinucléotide cyclique 2'3'-cGAMP. Le 2'3'-cGAMP est un activateur de la protéine STING (STimulator of INterferon Genes), qui déclenche la production d'interférons de type 1 et l'activation de la voie NF-kB dans les cellules. Il a été montré que la voie cGAS-STING est activée lors d'infections virales par des virus à ADN, et que cette activation a un rôle anti-viral, et dans certains cas anti-tumoral. Le 2'3'-cGAMP produit dans les cellules durant la production de lentivirus est empaqueté dans les particules lentivirales nouvellement produites, et délivré dans les cellules avoisinantes, déclenchant une réponse anti-virale rapide. Ce mécanisme ouvre la possibilité de produire des pseudo-particules non-infectieuses contenant le cGAMP afin de le libérer dans des cellules d'intérêt. Ces particules pseudo virales ont été nommées cGAMP virus-like particles (cGAMP-VLP). Le cGAMP-VLP constitue un produit qui a été breveté et qui est en cours de développement pré-clinique. L'objectif de cette thèse était d'améliorer la production au laboratoire du cGAMP-VLP, d'étudier son mécanisme d'action et de développer une seconde génération. J'ai optimisé le protocole de production des cGAMP-VLP dans le but de le rentre compatible avec une éventuelle exploitation industrielle. Ainsi, j'ai optimisé les plasmides utilisés, le réactif de transfection et le format de production. J'ai ensuite caractérisé la réponse interféron de type I in vitro de différentes lignées cellulaires et de cellules primaires pertinentes dans le cadre d'une injection intra-tumorale de cGAMP-VLP. J'ai réalisé ces expériences en comparaison avec les di-nucléotides cycliques, ce qui m'a permis de mettre en évidence des spécificités de réponse pour le cGAMP-VLP. Enfin, j'ai analysé ex vivo la capture de cGAMP-VLP par des cellules immunitaires murines primaires, et j'ai pu montrer une capture préférentielle par les cellules dendritiques et les macrophages. Enfin, j'ai amorcé le développement de cGAMP-VLP ciblant spécifiquement des cellules d'intérêt. Ainsi, j'ai réalisé une preuve de concept avec des protéines virales qu'il était possible d'altérer le ciblage du cGAMP-VLP tout en conservant ses activités fusogènes. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis d'améliorer nos capacités de production de cGAMP-VLP, ont apporté des éléments nouveaux sur son mécanisme d'action et ont ouvert la voie vers une seconde génération de cGAMP-VLP. L'ensemble de ces travaux contribuera à amener le cGAMP-VLP vers un développement clinique.

Double stranded DNA in mammals is exclusively located inside the nucleus and in the mitochondria. Its presence in the cytosol is a marker of viral infection or cellular stress. Double stranded DNA is detected in the cytosol by the enzyme cGAS, that produces after activation the cyclic di-nucleotide 2'3'-cGAMP. 2'3'-cGAMP is an agonist of the STING protein (STimulator of INterferon Genes), that induces production of type I interferon and activates the NF-kB pathway in the cells. It has been shown that the cGAS-STING pathway is activated after infection by DNA viruses, and this activation has an anti-viral role, and in some cases also an anti-tumoral role. During lentivirus production, the 2'3'-cGAMP produced in the cells is packaged in newly produced lentiviral particles, and delivered to neighboring cells, inducing a rapid anti-viral response. This mecanism opens the possibility to produce non infectious viral like particles containing 2'3'-cGAMP for delivery in cells of interest. These viral like particles were named cGAMP virus like particles (cGAMP-VLP). The cGAMP-VLP is a product that has been patented and is in pre-clinical development. The goal of this thesis was to improve the production of cGAMP-VLPs in the laboratory, study its mecanism of action, and develop a second generation. I optimized the production protocol of the cGAMP-VLPs in order to make it compatible with a industrial production process. Thus, I optimized the transfection plasmids, the transfection reagent, and the production format. I then caracterized in vitro the type I interferon response of various cell lines and primary cells that are relevant in the case of an intra-tumoral injection of cGAMP-VLP. I compared these responses with the ones obtained with soluble cyclic di-nucleotides, and was able to show specificities of the reponses to cGAMP-VLPs. I then studied ex vivo the capture of cGAMP-VLPs by mouse primary immune cells, and I showed a preferential capture by dendritic cells and macrophages. Lastly, I started the development of cGAMP-VLPs able to target cells of interest. Using viral proteins, I made the proof of concept that it is possible to alter the cGAMP-VLP targets while keeping its fusogenic propreties intact. In conclusion, my PhD work improved our cGAMP-VLP production capacities, shed new light on its mecanism of action, and opened the way to a second generation cGAMP-VLPs. This work contributed to bringing the cGAMP-VLP closer to clinical developement.