MRP4 (ABCC4) plaquettaire : rôle dans la compartimentation de l'AMPc et dans la pharmacologie de l'aspirine

MRP4 (ABCC4) in platelet : role in cAMP compartimentation and aspirin pharmacology

• Auteur / Autrice : Alexandre Leuci
• Direction : Christilla Bachelot-Loza
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Hématologie
• Date : Soutenance le 14/12/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Innovations Thérapeutiques en hÉMostase (Paris ; 2006-....)
• Jury : Président / Présidente : Pascale Gaussem
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascale Gaussem, Alexandre Kauskot, Annabelle Prado Dupont, Jean-Christophe Gris, Corinne Frère
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Alexandre Kauskot, Annabelle Prado Dupont

Mots clés

Mots clés contrôlés

Effets physiologiques

Aspirine

Microdomaines membranaires

Plaquettes sanguines

Mots clés libres

Abcc4

Plaquettes

AMPc

Microdomaines

Aspirine

Abcc4

Platelet

AMPc

Microdomains

Aspirin

Résumé

Les plaquettes sanguines circulent dans le sang au repos, cet état inactivé étant maintenu par la production de prostacycline et de monoxyde d'azote par l'endothélium vasculaire. Ces deux agents activent respectivement les voies des nucléotides cycliques : AMPc et GMPc. La prostacycline (ou prostaglandine I2), après liaison au récepteur IP, active l'adénylate cyclase (AC) via une protéine Gs. L'AC activée est responsable de la formation d'AMPc intraplaquettaire qui conduit à une inhibition de l'activation plaquettaire. Afin de permettre l'activation plaquettaire, le taux d'AMPc est réprimé i) par l'action des phosphodiestérases (PDE), qui le dégradent, ii) l'ADP, qui en se fixant sur P2Y12 active une Gi inhibitrice de l'AC, iii) par son efflux du cytosol via notamment la protéine d'efflux MRP4 (ABCC4), et iv) par une compartimentation subcellulaire de la voie de l'AMPc, mécanisme très peu documenté dans les plaquettes. Outre son rôle dans l'homéostasie de l'AMPc, de récentes études suggèrent que MRP4 serait également associée à des états de résistance plaquettaire à l'aspirine. En effet, un traitement par aspirine au long cours induirait une surexpression de MRP4 dans les plaquettes et cette surexpression serait par la suite responsable de l'efflux de l'aspirine hors des plaquettes, diminuant alors son efficacité. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'étudier la régulation de la voie de l'AMPc sous forme de microdomaines et l'impact d'un traitement par l'aspirine in vivo sur l'expression de MRP4 et sa répercussion sur l'homéostasie de l'AMPc. L'étude de la répartition des acteurs de la voie de l'AMPc révèlent une répartition non homogène au sein des membranes. En effet, une partie des acteurs sont présents hors des radeaux lipidiques membranaires bien qu'une fraction de PKA ainsi que de Gi soient présents dans les radeaux lipidiques. Cette répartition suggère diverses voies de régulation de la voie de l'AMPc. En effet, la présence d'acteurs hors des radeaux lipidiques est compatible avec le modèle d'organisation sous forme de microdomaines à AMPc comprenant la voie de synthèse (Gs, ACIII), l'effecteur PKA mais également la voie de régulation par les PDEs 2A et 3A. Ces microdomaines pourraient alors réguler localement la réponse plaquettaire. Par ailleurs, la présence d'acteurs de la voie de l'AMPc dans les radeaux lipidiques est compatible avec le modèle d'organisation ayant pour rôle de produire de l'AMPc qui diffuse plus facilement dans le cytoplasme (absence de PDE à proximité) pour exercer son effet inhibiteur, tout en maintenant un niveau d'inhibition contraint comme en témoigne l'augmentation de l'effet inhibiteur d'un activateur de la voie de l'AMPc lors de destruction des radeaux lipidiques. Ainsi l'organisation de la voie de l'AMPc sous différentes formes, en microdomaines AMPc ou non, pourrait impliquer des degrés différents d'inhibition plaquettaire par l'AMPc. Pour le second objectif, l'étude de différentes voies d'administration de l'aspirine chez deux souches de souris nous a permis de définir la voie orale comme étant la voie la plus appropriée pour l'étude de l'effet anti plaquettaire de l'aspirine. Son effet est mesurable 30 min après administration et reste mesurable à 3 heures avec une meilleure reproductibilité chez la souche C56/BL6. La dose de 100 mg/Kg induit une augmentation du temps de saignement et inhibe l'activité plaquettaire comme le montre une inhibition de 50 % de l'agrégation au collagène et la baisse de 85 % de la production de thromboxane B2. L'administration de l'aspirine durant 4 jours permet d'induire une augmentation de l'expression plaquettaire de MRP4 d'un facteur 2,5. Ce travail a permis de mieux caractériser le rôle de MRP4 dans la voie de l'AMPc et de définir le modèle préclinique d'administration de l'aspirine afin d'étudier le rôle de MRP4 dans la résistance au traitement.

Blood platelets circulate in blood at resting state, this inactivated state being provided by the prostacyclin and nitric oxide production by the vascular endothelium. These two agents respectively activate the cyclic nucleotide pathways: cAMP and cGMP. Prostacyclin (or prostaglandin I2), after binding to the IP receptor, activates adenylate cyclase (AC) via a Gs protein. Activated AC is responsible for the formation of intraplatelet cAMP which leads to inhibition of platelet activation. In order to allow platelet activation, the level of cAMP is repressed i) by the action of phosphodiesterases (PDE), which hydrolyse it, ii) ADP, which by binding to P2Y12 activates a Gi protein that inhibit AC, iii) by its efflux from the cytosol via in particular a efflux protein MRP4 (ABCC4), and iv) by subcellular compartmentalisation of the cAMP pathway, a mechanism that has been poorly documented in platelets. In addition to its role in cAMP homeostasis, recent studies suggest that MRP4 is also associated with platelet aspirin resistance. In fact, long-term treatment with aspirin would induce an overexpression of MRP4 in the platelets and this overexpression would subsequently be responsible for the efflux of aspirin out of the platelets, thus reducing its effectiveness. The work presented in this thesis aimed to study the regulation of the cAMP pathway in the form of microdomains and the impact of an aspirin treatment in vivo on the expression of MRP4 and its repercussion on cAMP homeostasis. The study of the distribution of actors in the cAMP pathway reveals a non-homogeneous distribution within the membranes. Indeed, some of the actors are present outside the membrane lipid rafts although a fraction of PKA as well as Gi are present in the lipid rafts. This distribution suggests various regulatory pathways for the cAMP pathway. Indeed, the presence of actors outside the lipid rafts is compatible with the organizational model in the form of cAMP microdomains comprising the synthesis pathway (Gs, ACIII), the PKA effector but also the regulatory pathway by PDEs. 2A and 3A. These microdomains could then locally regulate the platelet response. In addition, the presence of actors in the cAMP pathway in lipid rafts is compatible with the organizational model whose role is to produce cAMP which diffuses more easily in the cytoplasm (absence of PDE nearby) to exert its inhibitory effect, while maintaining a constrained level of inhibition as evidenced by the increased inhibitory effect of an activator of the cAMP pathway during the destruction of lipid rafts. Thus, the organization of the cAMP pathway in different forms, into cAMP microdomains or not, could imply different degrees of platelet inhibition by cAMP. For the second objective, the study of different routes of administration of aspirin in two strains of mice allowed us to define the oral route as being the most appropriate route for the study of the antiplatelet effect of the 'aspirin. Its effect is measurable 30 min after administration and remains measurable at 3 hours with better reproducibility in the C56 / BL6 strain. The dose of 100 mg / Kg induces an increase in bleeding time and inhibits platelet activity as shown by a 50% inhibition of collagen aggregation and an 85% decrease in the production of thromboxane B2. Administration of aspirin for 4 days results in an increase in platelet expression of MRP4 by 2.5 fold. This work allowed to better characterize the role of MRP4 in the cAMP pathway and to define the preclinical model of administration of aspirin in order to study the role of MRP4 in resistance to treatment.