Amélioration par stress abiotique de la production d' un métabolite secondaire présentant une puissante activité antitumorale chez une cyanobactérie : Nostoc sp. ATCC 53789. Investigation phytochimique de la souche

Improvement of the production of a secondary metabolite with potent anticancer activity in cyanobacterium Nostoc sp. ATCC 53789, using abiotic stress : phytochemical investigation of this strain

• Auteur / Autrice : Alexandros Polyzois
• Direction : Sylvie Michel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacognosie
• Date : Soutenance le 16/12/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cibles thérapeutiques et conception de médicaments (Paris ; 2019-....)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Grovel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Grovel, Muriel Gugger, Diana Kirilovsky
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Olivier Grovel, Muriel Gugger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anticancéreux

Cyanobactéries

Métabolites

Mots clés libres

Cryptophycine

Nostoc sp

Atcc 53789

Cyanotoxine

Abiotic stress

Réseaux moléculaires

Uhplc-Hrms²

Photobioréacteur

Cryptophycin

Nostoc sp

Atcc 53789

Cyanotoxin

Abiotic stress

Photobioreactor

Molecular networking

Uhplc-Hrms²

Résumé

Les cyanobactéries sont un des plus anciens et des plus grands groupes de bactéries sur la terre. Elles produisent de nombreux composés utiles pour l'homme et ses activités, allant des biofuels jusqu'aux nutriments. Certaines espèces produisent cependant des métabolites secondaires toxiques comme les cyanotoxines. L' étude de ces toxines peut conduire à de nouveaux agents pharmaceutiques doués d'un intérêt thérapeutique. Parmi ces composés, la cryptophycine-1 est un composé qui s'est montré posséder des propriétés antitumorales significatives confirmées par des essais cliniques. Le mécanisme d'action fait intervenir une interaction avec le domaine Vinca de la tubuline. La dynamique des microtubules est détruite conduisant à l'entrée en apoptose des cellules. Malheureusement, malgré l'intérêt thérapeutique et la grande puissance de ce composé, sa production industrielle n'est pas évidente, en particulier par synthèse totale. La culture sous stress biotique ou abiotique des cyanobactéries en modifiant les conditions de culture peut apparaitre comme un moyen d'accroître le rendement de production des métabolites. Notre travail a porté sur la souche Nostoc sp. ATCC 53789 qui est actuellement la seule souche commerciale disponible parmi les trois souches productrices de ce métabolite. Nous avons donc étudié les effets d'une gamme de paramètres abiotiques sur la croissance de la souche en culture et la production de cryptophycine. L'effet de la lumière : photopériode, intensité, longueur d'onde a tout d'abord été étudié. L'influence d'autres facteurs comme le pH, la température et la composition des milieux de culture a également été évaluée. Enfin, les différents paramètres de culture optimisés ont été appliqués à une production en photobioréacteur afin de déterminer si lors d'une culture à plus large échelle, un effet de synergie pouvait être observé. Pour chacun des paramètres étudiés, la croissance de la biomasse est appréciée par mesure de la densité optique ou de sa masse et la production de cryptophycine déterminée, selon une méthode HPLC mise au point afin permettre la mesure de petites concentrations en cryptophycine. Les courbes de croissance de la biomasse et de production de cryptophycine ont ainsi pu être tracées. Les rendements optimums ont été obtenus avec un éclairage par une lumière orange-rouge avec une exposition constante à une lumière d'intensité moyenne. Pour la croissance de Nostoc sp. la présence de nitrates dans le milieu est nécessaire et cette croissance est meilleure si la souche est cultivée à une température de 25 degrés à un pH compris entre 8.5-9.0. L'application de l'ensemble des conditions optimales a permis de constater un effet synergique positif. La culture en photobioréacteur, en appliquant les conditions optimales combinées, montrent une augmentation significative de la production de cryptophycine avec cependant, une croissance plus lente de la souche. Enfin, la dernière partie de ce travail, se propose d'établir, en dehors de la présence de cryptophycine -1 déjà établie, une première approche phytochimique de la souche Nostoc sp. ATCC 53789. Des extraits réalisés à partir de biomasses obtenues dans différentes conditions de culture ont été soumis à des analyses UHPLC-ESI-Q-TOF-HRMS². Les données obtenues ont permis de construire des réseaux moléculaires permettant d'observer la présence d'analogues de série cryptophycine. Neuf analogues potentiels de série cryptophycine non encore identifiés dans cette souche, à ce jour, ont pu être mis en évidence. Ces derniers sont principalement produits en phase exponentielle tardive. Dans les conditions optimisées, la production des dérivés de série cryptophycine semblent surexprimée. Les résultats de ce travail jettent les bases d'une recherche approfondie sur l'exploitation industrielle de cyanobactéries pour la production d'agents anticancéreux.

Cyanobacteria is one of the most ancient and largest groups of bacteria on earth. They produce a range of compounds useful for human activities, from biofuels to nutrition. They also, however, produce secondary metabolites with toxic effect, the cyanotoxins. The study of these toxins may lead to novel pharmaceutical agents. We examined the cyanotoxin cryptophycin-1, as it has been reported to possess significant anticancer properties. It interacts with tubulin's Vinca domain and disrupts the microtubule's dynamics leading to apoptosis. Unfortunately, despite its high potency, its synthesis provides insufficient yield for industrial use. However, stressing cyanobacteria by modification of the culture's environmental conditions, can be a means for increasing metabolite's production yield. Our work was performed with Nostoc sp. ATCC 53789 which is currently the only commercially available strain among the three species producing this metabolite. We examined a range of abiotic culture parameters in relation to light conditions (photoperiod, intensity, wavelength), pH, temperature and medium composition. Then, the synergic effect of combined conditions was evaluated, as well as the effect of high-scale cultivation in a photobioreactor. Growth was measured and metabolite concentration was calculated through an HPLC method, developed for small-volumes quantification. Growth and toxin's productivity curves were then drawn. It was concluded that orange-red constant light of medium intensities provided the optimum yield. Nitrates were also needed in medium, while the strain performed better at 25°C and in a pH range 8.5-9.0. Moreover, the combined conditions were shown to have a positive synergic effect, while the cultivation in a photobioreactor increased significantly the obtained yield, even if the growth rate was lower. In addition to the examination of cryptophycin-1, the total molecular fingerprint of the strain was examined by molecular networks from UHPLC-ESI-Q-TOF-HRMS² analysis. Finally, these results indicate the presence of 9 cryptophycin-analogues and their respective proportions in Nostoc sp. ATCC 53789, unidentified in this strain to this date. Through the molecular networks' aspect, the analogues were observed to be mostly expressed in the late exponential phase and under the developed combined optimal culture conditions, the major analogues seemed to be overexpressed. The results of this work set the grounds for further research and industrial exploitation in the field of novel cyanobacterial anticancer agents.