Décrypter les mécanismes régulant l'expression et la sécrétion de la nouvelle génotoxine bactérienne EndA et son rôle dans la virulence de Shigella flexneri

Deciphering the mechanisms regulating the expression and secretion of the novel bacterial genotoxin EndA and its roles in Shigella flexneri virulence

• Auteur / Autrice : Xiangyan He
• Direction : Laurence Arbibe-Mira
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 16/12/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Necker Enfants-Malades (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Bouloc
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Bouloc, Jean-Philippe Nougayrede, Nicolas Barnich, Cécile Arrieumerlou, Olivera Francetic
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Philippe Nougayrede, Nicolas Barnich

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutagènes

Neutrophiles

Pyruvate déshydrogénase

Shigella flexneri

Mots clés libres

Shigella flexneri

Génotoxines

EndA

FNR

Vésicules à membrane externe

Pyruvate déshydrogénase

Polynucléaires neutrophiles

Shigella flexneri

Genotoxins

EndA

FNR

Outer membrane vesicules

Pyruvate dehydrogenase

Polymorphonuclear neutrophils

Résumé

Les génotoxines bactériennes sont définies comme des toxines dont la cible moléculaire directe est l'ADN eucaryote. Bien que les effets génotoxiques des infections bactériennes aient été documentés, un nombre très limité de génotoxines bactériennes a été clairement identifié. L'entéropathogène Shigella flexneri induit un stress génotoxique dans les cellules épithéliales. En utilisant une approche biochimique combinant chromatographie et spectrométrie de masse, le laboratoire a identifié l'endonuclease EndA, dont le gène est codé par le chromosome bactérien, comme la principale cause de stress génotoxique lors d'une infection à Shigella. Dans ce contexte, nous avons d'abord étudié les mécanismes régulant l'expression et la sécrétion de cette génotoxine. En condition d'anaérobie, nous montrons que FNR (Fumarate and Nitrate reductase Regulatory), un régulateur transcriptionnel sensible à l'oxygène de E. Coli nécessaire pour le passage du métabolisme aérobie au métabolisme anaérobie, est un régulateur positif de l'expression de EndA. Dans des conditions aérobies, nous montrons que l'expression de EndA est biphasique, prédominante lors de la croissance exponentielle et sous la dépendance de la pyruvate déshydrogénase (PDH), un complexe enzymatique métabolique impliqué dans la conversion du pyruvate en acétyl-CoA et NADH. De plus, nous montrons que la toxine est co-exprimée avec la sous unité E1 du complexe PDH dans chaque étape de la croissance bactérienne. De façon intéressante, nous montrons que EndA et le composant pyruvate déshydrogénase E1 forment un complexe moléculaire, ce qui suggère la possibilité que la PDH puisse être une protéine à multiples fonctions de type « moonlighting », agissant à la fois comme une enzyme métabolique et un chaperon moléculaire stabilisant l'expression de la protéine EndA. Afin d'identifier des partenaires moléculaires impliqués dans la sécrétion de EndA, nous avons réalisé une analyse en protéomique de l'interactome EndA. Les composants du système de sécrétion de type III et les protéines de la membrane externe ont été identifiés comme des interactants potentiels de EndA. Nous démontrons que le signal peptidique N-terminal de la toxine est nécessaire pour son transport du cytoplasme au périplasme, ce qui rend EndA principalement localisée dans le périplasme de la bactérie, favorisant ainsi sa libération par la production de vésicules de membrane externe (OMV). Enfin, nous avons étudié l'implication de EndA dans la virulence de Shigella flexneri. Dans les lignées de cellules entérocytaires infectées, nous montrons que EndA restreint le nombre de bactéries intra-cellulaires, limitant ainsi la mort de sa niche épithéliale. De plus, dans un modèle cobaye d'entérite aiguë dans le côlon, nous montrons que EndA induit des dommages à l'ADN dans les cellules épithéliales de l'hôte et de manière inattendue dans les polynucléaires neutrophiles (PMNs). De manière cohérente, nous montrons in vitro que EndA déclenche un stress génotoxique dans la lignée cellulaire HL60 de type neutrophile et dans les PMNs humains. De plus, EndA limite la formation de pièges extracellulaires des neutrophiles (NET) in vitro, suggérant que l'activité DNase de la toxine pourrait constituer une stratégie bactérienne d'échappement à la destruction par les PMNs. En conclusion, nos travaux caractérisent un nouveau membre de la famille des génotoxines bactériennes, et révèle les fonctions potentielles de cette famille d'effecteurs bactériens dans l'adaptation bactérienne à la niche de l'hôte et l'immunité infectieuse.

Bacterial genotoxins are unique among toxins as their direct molecular target is eukaryotic DNA. Although multiple lines of evidence point to the genotoxic effects of bacterial infections, a very limited number of bacterial genotoxins have been clearly assigned. The enteropathogen Shigella flexneri causes a genotoxic stress in epithelial cells. Using a biochemical approach combining chromatography and mass spectrometry, the lab has identified the chromosomally-encoded protein DNAse called EndA as the main cause of chromatin injury during Shigella infection. In this context, we firstly investigated the mechanisms regulating the expression and secretion of this genotoxin. Upon anaerobic condition, we find that FNR (Fumarate and Nitrate reductase Regulatory) an E. coli oxygen - responsive transcriptional regulator required for the switch from aerobic to anaerobic metabolism is a positive regulator of EndA expression. Upon aerobic conditions, we show that the expression of EndA is biphasic, predominant during exponential growth and under the dependence of the pyruvate dehydrogenase (PDH), a critical enzymatic complex involved in pyruvate conversion into acetyl-CoA and NADH. Moreover, we showed that the toxin is coexpressed with the pyruvate dehydrogenase E1 component of the PDH complex in each phase of cell growth. Interestingly, we found that EndA and the pyruvate dehydrogenase E1 component form a molecular complex, raising the possibility that the PDH is a moonlighting protein, acting both as a metabolite enzyme and a molecular chaperon stabilizing EndA protein expression. To identify potential molecular partners involved in EndA secretion, we have performed an interactome proteomic analysis. Component of the type III secretion system and outer membrane proteins were identified as potential endA interactants. We demonstrate that the N-terminal peptide signal is required for the transport of EndA from the cytoplasm to the periplasm, making EndA predominantly located in the bacterium periplasm and further released through the production of Outer Membrane Vesicules (OMVs). Finally, we have investigated the implication of EndA in Shigella flexneri virulence. In infected enterocytic cell lines, we show that EndA restricts Shigella intra-cellular number, thereby restraining the death of its epithelial niche. Moreover, in a guinea pig model of acute enteritis in the colon, we show that EndA induces DNA damage in host epithelial cells and unexpectedly in polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Consistently, we show in vitro that EndA triggers a genotoxic stress in the neutrophil-like HL60 cell line and in human PMNs. Importantly, EndA reduces the neutrophil extracellular trap formation in vitro, suggesting that EndA DNase activity might helps Shigella flexneri escape from killing by PMNs. Overall, our work uncovers a new member of the bacterial genotoxin family, and reveals potential functions of this family of bacterial effectors on bacterial adaptation to host niche and infectious immunity.