Co-encapsulation de la fisétine et du cisplatine dans des liposomes pour le traitement de cancers vascularisés.

Co-encapsulation of fisetin and cisplatin in liposomes for the treatment of vascularized tumors

• Auteur / Autrice : Morgane Renault
• Direction : Karine Andrieux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biothérapie
• Date : Soutenance le 04/06/2020
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Amélie Bochot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Amélie Bochot, Marie-Paule Mingeot, Guillaume Bastiat
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Amélie Bochot, Marie-Paule Mingeot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Encapsulation (chimie)

Cisplatine

Fisétine

Flavonoïdes

Cancer -- Thérapeutique

Liposomes

Nanomédecine

Mots clés libres

Nanomédecine

Liposomes

Co-encapsulation

Cancer

Flavonoïdes

Fisétine

Cisplatine

Nanomedicine

Liposomes

Co-encapsulation

Cancer

Flavonoids

Fisetin

Cisplatin

Résumé

L'émergence de la nanomédecine dans la lutte pour le cancer a conduit à la commercialisation de plusieurs formulations liposomales de molécules cytotoxiques dont l'association cytarabine/daunorubicine (Vyxeos®). L'association de plusieurs molécules agissant par des mécanismes différents est une stratégie couramment employée afin de lutter contre la chimiorésistance. L'utilisation des nanovecteurs pour co-encapsuler plusieurs substances actives pourrait permettre de délivrer l'association des chimiothérapies dans un rapport synergique au sein de la tumeur en s'affranchissant des différences de pharmacocinétique et de biodistribution de ces molécules. Ce travail porte sur la co-encapsulation de deux molécules, la fisétine et le cisplatine, dans un seul nanovecteur dans l'objectif 1/ d'exercer une action synergique en combinant l'effet anti-angiogénique de la fisétine avec l'effet cytotoxique du cisplatine, 2/ de pouvoir administrer la fisétine, molécule fortement insoluble dans l'eau, et 3/ de réduire la toxicité du cisplatine en utilisant le ciblage passif du cisplatine vers les tumeurs fortement vascularisées grâce à l'effet EPR (enhanced permeability and retention). Le choix du nanovecteur s'est porté sur les liposomes du fait de leur capacité à pouvoir encapsuler des molécules hydrophiles dans leur coeur aqueux et lipophiles dans leur bicouche lipidique. La première partie de ce travail a consisté en la mise au point et la validation des méthodes de dosages nécessaires pour l'évaluation des liposomes préparés. La deuxième partie a porté sur l'optimisation du procédé de préparation et de la formulation des liposomes. Le procédé optimisé a consisté en la méthode d'hydratation de film suivie d'une extrusion au travers de membranes de polycarbonate de porosité 0,4 et 0,2 µm et d'une purification par dialyse suivie d'une filtration. Le challenge de la formulation portait sur l'optimisation du rapport molaire cholestérol/phospholipides afin de permettre l'incorporation de la fisétine dans la bicouche lipidique tout en retenant le cisplatine dans le coeur aqueux. Nos travaux ont montré que la solubilité de la fisétine dans la bicouche lipidique était de 3,2% w/w environ et qu'à partir de 29,6% molaire de cholestérol dans la formulation lipidique la fisétine n'était plus incorporée. La formulation optimisée comporte un rapport molaire DOPC/cholestérol/DSPE-PEG2000 de 75,3/20,8/3,9 et permet d'encapsuler la fisétine et le cisplatine avec un drug loading de 2,10 ± 0,33 et 0,85 ± 0,09 respectivement dans des liposomes faisant 166 ± 14 nm de diamètre (PDI = 0,13 ± 0,04). Un procédé de lyophilisation a été développé afin d'améliorer la stabilité de la préparation. La troisième partie du travail a porté sur l'évaluation de la formulation in vitro sur une lignée de cellules endothéliales et deux lignées tumorales de glioblastome et de cancer du poumon, et in vivo sur un modèle murin ectotopique de Lewis Lung carcinoma. Nous avons montré pour la première fois à notre connaissance une activité de la fisétine sur les cellules de glioblastome U 87-MG, un effet synergique de la fisétine et du cisplatine co-encapsulés dans des liposomes ou en association sur les cellules de cancer du poumon 3LL, et une réduction de la toxicité in vivo du cisplatine grâce à la co-encapsulation. Ces résultats prometteurs démontrent l'intérêt de la co-encapsulation de molécules actives dans des liposomes pour une activité synergique anti-cancéreuse.

The emergence of nanomedicine in the fight against cancer has led to the commercialization of several liposomal formulations of cytotoxic drugs, including the combination cytarabine/daunorubicin (Vyxeos®). The combination of different drugs with different mechanisms of action is a commonly used strategy to prevent the emergence of resistance during chemotherapy. The use of nanocarriers to co-encapsulate several active substances could make it possible to deliver the association of chemotherapies in a synergistic ratio within the tumor by overcoming differences in pharmacokinetics and biodistribution of these drugs. This work consisted in the co-encapsulation of two drugs, fisetin and cisplatin, in one nanocarrier to aim to 1/ obtain a synergistic effect by combining the anti-angiogenic effect of fisetin with the cytotoxic effect of cisplatin, 2/ administrate fisetin, hihgly insoluble in water and 3/ decrease cisplatin toxicity by passive targeting to highly vascularized tumors using the EPR effect (enhanced permeability and retention). The choice of the nanocarrier fell on liposomes able to encapsulate hydrophilic molecules in their aqueous core and lipophilic ones in their lipid bilayer. The first part of this work presented the development and validation of the assay methods necessary for the evaluation of the prepared liposomes. The second part focused on optimizing the preparation process and the formulation of the liposomes. The optimized process consisted of the thin-film hydration method followed by extrusion through polycarbonate membranes with porosity of 0.4 and 0.2 µm and purification by dialysis followed by filtration. The challenge of the formulation development was the optimization of the cholesterol/phospholipid molar ratio in order to allow the incorporation of fisetin in the lipid bilayer while retaining cisplatin in the aqueous core. Our work has shown that the solubility of fisetin in the lipid bilayer was approximately 3.2% w/w and that above 29.6mol% of cholesterol in the lipid formulation fisetin was no longer incorporated. The optimized formulation was composed by DOPC/cholesterol/DSPE-PEG2000 at a molar ratio of 75.3/20.8/3.9 and encapsulated fisetin and cisplatin with a drug loading of 2.10 ± 0.33 and 0.85 ± 0.09 respectively in liposomes with a diameter of 166 ± 14 nm (PDI = 0.13 ± 0.04). A freeze-drying process was developed to stabilize as a function of time the formulation. The third part of the work focused on the evaluation of the in vitro formulation on an endothelial cell line and two tumor cell lines of glioblastoma and lung cancer, and in vivo on an ectotopic mouse model of Lewis Lung carcinoma. We have shown for the first time to our knowledge a cytotoxic activity of fisetin on glioblastoma U 87-MG cells, a synergistic effect of fisetin and cisplatin co-encapsulated into liposomes or in association on lung cancer cells 3LL, and a reduction in the in vivo toxicity of cisplatin through co-encapsulation with fisetin. Those promising results evidenced the interest of co-encapsulation of active molecules into liposomes for synergistic anti-cancer activity.