Protéines et phospholipides du fluide tubaire participant au dialogue embryo-maternel et à la qualité de l'embryon pré-implantatoire chez le bovin

Proteins and phospholipids of the oviductal fluid contributing to the embryo-maternal dialog and to the quality of the pre-implantation embryo in cattle

• Auteur / Autrice : Charles Banliat
• Direction : Marie Saint-Dizier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie. Biologie de la reproduction
• Date : Soutenance le 14/10/2020
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiologie de la Reproduction et des Comportements (Tours)
• Jury : Président / Présidente : Thierry Moreau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sophie Réhault-Godbert, Florence Baume Brugnon, Benoît Guyonnet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Christophe Arnoult, Jo Leroy

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maturation ovocytaire in vitro

Protéines de la matrice extracellulaire

Lipidomique

Protéomique

Trompe utérine

Poids moléculaires

Interactions phospholipide-protéine

Cellules souches embryonnaires

Échanges foetomaternels

Reproduction (biologie) -- Régulation

Bovins

Mots clés libres

Oviducte

Embryon

Fluide tubaire

Lipidomique

Vésicules extracellulaires

Protéomique

Oviduct

Embryo

Oviductal Fluid

Lipidomics

Extracellular Vesicles

Proteomics

Résumé

Le développement in vitro (DIV) d’embryons de mammifères est une biotechnologie utile pour la sélection des animaux d’élevage, pour la conservation et la gestion des espèces menacées, mais aussi dans le cadre de l’assistance médicale à la procréation humaine. Cependant, la qualité, la résistance à la cryoconservation et l’aptitude à l’implantation des embryons issus de DIV sont inférieures à celles des embryons développés in vivo, dans l’organisme maternel. L’oviducte est l’organe maternel dans lequel débute le développement embryonnaire. Des travaux récents montrent que le dialogue embryo-maternel débute au sein de l’oviducte et contribue à la qualité de l’embryon. Cependant, les molécules échangées dans ce dialogue précoce et la cinétique des interactions au cours du développement ne sont pas connues. Notre hypothèse de travail est que l’embryon bovin capte des protéines et des phospholipides dans le fluide oviductal (tubaire), en partie par l’intermédiaire de vésicules extracellulaires oviductales (oEV), et que ces interactions sont dynamiques au cours du développement. Nos objectifs étaient de mieux connaitre la composition en phospholipides et protéines du fluide tubaire et d’identifier les molécules captés par l’embryon, les mécanismes d’interaction et leurs effets sur le développement précoce.Dans une première partie, les phospholipides du fluide tubaire bovin ont été analysés en spectrométrie de masse (MALDI-TOF et nanoLC-MS/MS) au cours du cycle et en fonction de la proximité de l’ovaire ovulant. Plus de 270 masses lipidiques incluant une majorité de glycérophospholipides, lysophospholipides, sphingomyélines et carnitines ont été mises en évidence. Parmi ces masses, 127 varient en abondance aux stades péri-ovulatoires par rapport à la phase lutéale du cycle et constituent des candidates intéressantes pour la régulation du développement embryonnaire. Une seconde analyse en nanoLC-MS/MS du fluide tubaire post-ovulatoire a permis d’identifier plus de 1700 protéines. Dans une deuxième partie, nous avons étudié les effets des oEV, riches en phospholipides, sur le développement in vitro et le profil lipidomique des embryons bovins. L’exposition aux oEV n’a pas modifié le développement et la cryotolérance des embryons. Les blastocystes exposés aux oEV ont une abondance plus élevée en phosphatidylcholines (PC), phosphatidyléthanolamines (PE) et sphingomyélines (SM) à haut poids moléculaire (avec des acides gras à longues chaines) par rapport aux embryons témoins, avec des changements spécifiques avant et après expansion du blastocœle. La majorité (82%) des phospholipides surabondants dans les embryons traités ont aussi été identifiés dans les oEV, mettant en évidence un transfert probable de phospholipides des oEVs vers les membranes embryonnaires.Dans une troisième partie, nous avons étudié les effets du fluide tubaire sur la composition protéomique d’embryons bovins issus de DIV aux stades 4-6 cellules et morula. L’analyse différentielle a permis d’identifier 56 protéines oviductales interagissant avec l’embryon, dont l’oviductine (OVGP1) et plusieurs annexines (ANXA1, ANXA5 et ANXA8) parmi les plus abondantes. Certaines protéines n’interagissent qu’à un stade embryonnaire donné, suggérant des interactions dynamiques et différentielles au cours du développement. Une analyse en immunohistochimie a montré que ces protéines peuvent traverser la zone pellucide et peuvent être captées par les cellules embryonnaires. Une analyse in silico a mis en évidence une sécrétion non conventionnelle ou via les oEV pour 91% des protéines d’interaction, et de multiples rôles pour le métabolisme et les processus cellulaires.Les résultats obtenus au cours de cette thèse permettent de mieux comprendre le dialogue embryo-maternel précoce et ouvrent des perspectives intéressantes pour l’amélioration des milieux de développement in vitro.

The in vitro culture (IVC) of mammalian embryos is a useful biotechnology for animal breeding, the conservation and management of endangered species, but also in the context of medically assisted human reproduction. However, the quality, resistance to cryopreservation and ability for implantation of embryos derived from IVC are lower than those conceived in vivo, in the maternal environment. The oviduct is the maternal organ where early embryo development takes place. Recent work shows that the embryo-maternal dialog begins in the oviduct and contributes to the quality of the embryo. However, the molecules exchanged in this early dialogue and the kinetics of interactions during development are not known. Our working hypothesis is that the bovine embryo takes up proteins and phospholipids from the oviductal (tubal) fluid, partly via oviductal extracellular vesicles (oEVs), and modulates these interactions for optimal development. Our objectives were to better understand the phospholipid and protein composition of the tubal fluid and to identify the molecules taken up by the embryo, the mechanisms of interaction and their effects on development.In a first part, phospholipids in the bovine tubal fluid were analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOF and nanoLC-MS/MS) during the cycle and according to the proximity of the ovulating ovary. More than 270 lipid masses, including a majority of glycerophospholipids, lysophospholipids, sphingomyelins (SM) and carnitines, were detected. Of these masses, 127 varied in abundance in the peri-ovulatory stages compared to the luteal phase of the cycle and constitute candidates for the regulation of embryonic development. A second nanoLC-MS/MS analysis of the post-ovulatory tubal fluid identified more than 1700 proteins. In a second part, the effects of oEVs, rich in phospholipids, on in vitro development of bovine embryos and their lipidomic profile were studied. Exposure to oEVs did not alter blastocyst rates and cryotolerance. Blastocysts exposed to oEVs had a higher abundance of high molecular weight (with long-chain fatty acids) phosphatidylcholines (PC), phosphatidylethanolamines (PE) and SM compared to control embryos, with specific changes before and after blastocoel expansion. The majority (82%) of the superabundant phospholipids in treated embryos were also identified in oEVs, evidencing a probable transfer of lipids from oEVs to embryo membranes, and the modulation of the embryo lipid metabolism by oEV molecular cargos.In a third part, we studied the effects of tubal fluid on the proteomic composition of bovine embryos derived from IVC at the 4-6 cell and morula stages. Differential analysis identified 56 oviductal proteins interacting with the embryo, including oviductin (OVGP1) and several annexins (ANXA1, ANXA5 and ANXA8) as the most abundant ones. Some proteins interacted only at a given embryonic stage, highlighting the modulating role of the embryo in the interactions. Using immunohistochemistry, we showed that the interacting proteins can cross the zona pellucida and be taken up by embryonic cells. An in silico analysis showed that 91% of the interacting proteins are secreted by unconventional ways of secretion or via oEVs, and that these proteins play multiple roles in metabolism and cellular processes.The results obtained in this thesis provide a better understanding of the early embryo-maternal dialog and open up interesting perspectives for the improvement of in vitro culture media.