Génération et caractérisation de nouveaux peptides et protéines bifonctionnels pour des applications pharmaceutiques

Generation and characterization of novel bifunctional protein and peptides for pharmaceutical applications

• Auteur / Autrice : Baptiste Gouyou
• Direction : Philippe Valet, Mattia Matasci
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Maladies métaboliques et cardiovasculaires
• Date : Soutenance le 17/12/2020
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (Toulouse ; 2011-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anticorps

Protéines multifonctionnelles

Biomédicaments

Mots clés libres

Anticorps

Cancer

Cytokine

Ciblage thérapeutique

Maladie inflammatoire

Couplage de protéines

Antibody

Cancer

Cytokine

Therapeutic targeting

Inflammatory disease

Protein coupling

Résumé

Les protéines ou peptides multi-spécifiques représentent une nouvelle génération de produits biopharmaceutiques prometteurs pour une application thérapeutique. Ces biomédicaments offrent la possibilité de combiner des molécules aux fonctions spécifiques comme l’ajout d’une activité thérapeutique, la localisation spécifique au sein de la maladie et une possible amélioration de la demi-vie. Le ciblage d’antigènes spécifiques aux maladies par le biais d’anticorps ou de petites molécules a largement été exploré pour la livraison sélective de charge thérapeutique (e.g., cytokine, cytotoxiques ou radionucléides) au sein de la maladie. Le choix de l’antigène est d’une importance cruciale pour le développement de molécules de ciblage. Les isoformes d'épissage alternatif de la fibronectine, comme celles contenant l'extra-domaine A (EDA), sont des marqueurs du remodelage de la matrice extracellulaire. Surexprimé dans différentes pathologies (cancer, maladies inflammatoires), EDA est pratiquement absent des tissus sains. De même, l'anhydrase carbonique IX (CAIX) est un antigène tumoral surexprimé à la surface de 90% des carcinomes des cellules rénales, mais dont l’expression dans les tissus sains est limitée à certaines structures gastro-intestinales. Ces antigènes représentent d'excellentes cibles moléculaires pour les applications de ciblage thérapeutique. Une variété de cytokines ou de molécules bioactives ont été fusionnées à des anticorps (immunocytokines et conjugués anticorps-médicament) et à de petites molécules (conjugués médicament-ligand à petite molécule), afin d'améliorer leurs propriétés thérapeutiques. Certaines molécules bifonctionelles ont démontré une efficacité préclinique prometteuse et sont actuellement en phase de recherche clinique pour différentes pathologies. Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé différentes méthodologies pour générer des molécules bifonctionnelles et évaluer leurs propriétés thérapeutiques et pharmacocinétiques. Incités par la potentielle activité de l'interleukine 9 (IL9) dans l'immunité anti-tumorale et la résolution inflammatoire de l'arthrite, nous avons génétiquement généré des protéines de fusion anticorps-cytokines (immunocytokines) basées sur l'IL9 et l'anticorps F8, reconnaissant spécifiquement l’EDA. Une variante d'immunocytokine avec la meilleure efficacité de ciblage in vivo a été testée de manière plus approfondie pour son efficacité thérapeutique dans divers modèles précliniques. Par la suite, nous avons étudié la possibilité d'utiliser des ligands moléculaires pour la livraison pharmacologique des cytokines. Nous avons utilisé l'enzyme Sortase A pour catalyser une liaison covalente entre deux séquences peptidiques spécifiques. Le produit obtenu, appelé AAZ-IL2, est la fusion entre l'acétazolamide, ligand de CAIX, et l'interleukine-2. AAZ-IL2 a conservé une activité de fixation au CAIX in vitro, mais une modeste efficacité de ciblage in vivo a pu être démontrée. Enfin, nous avons utilisé un assemblage chimique pour générer la fusion entre un peptide thérapeutique et une petite molécule spécifique à l'albumine humaine et murine. En raison de leur petite taille, les peptides ont une demi-vie très courte, limitant leur utilisation thérapeutique. Pour améliorer la pharmacocinétique de médicaments, l'albumine représente une cible intéressante, en raison de sa grande abondance dans le sang. L'Albutag, un ligand spécifique pour l'albumine, a été décrit comme pouvant prolonger la demi-vie de diverses molécules. Pour améliorer les propriétés pharmacocinétiques d'un peptide thérapeutique, nous avons généré une molécule de fusion peptide-Albutag, puis caractérisé son affinité pour l'albumine in vitro et ses propriétés pharmacocinétiques in vivo. Dans l'ensemble, les recherches présentées dans cette thèse peuvent être importantes pour la poursuite du développement de produits biopharmaceutiques bifonctionnels ayant des propriétés thérapeutiques et pharmaceutiques améliorées.

Multispecific molecules based on proteins or peptides represent a new generation of targeted biopharmaceuticals that hold great therapeutic promise. Engineered biotherapeutics drugs offer the possibility to combine multiple molecules with specific therapeutic functions featuring additional therapeutic activities, selective localization to the site of the disease and possibly extended half-life. Targeting disease-specific antigens with antibodies or small molecules has been an extensively explored strategy to selectively deliver therapeutically active payloads (e.g., cytokines, cytotoxic drugs or radionuclides) to the site of disease. The target antigen choice is of crucial importance for the successful development of targeted drugs. Alternative splice isoforms of fibronectin, such as the ones containing the extra-domain A (EDA), are extracellular matrix markers of tissue remodeling. EDA is overexpressed in different pathological conditions, including cancer and inflammatory diseases, but it is virtually absent from adult healthy tissues. Similarly, carbonic anhydrase IX (CAIX) is a cell surface tumor-associated antigen, which is overexpressed in 90% of renal cell carcinomas, but in healthy tissues his pattern of expression pattern is highly restricted to some gastrointestinal structures. Both EDA and CAIX represent excellent molecular targets for pharmacodelivery applications. Over the past two decades, a variety of cytokines or bioactive molecules have been fused to antibodies (e.g., immunocytokines and antibody drug conjugates) and small molecules (e.g., small molecule drug conjugates), in order to improve their therapeutic properties. Some of these bifunctional therapeutics have shown promising preclinical efficacy and have been further investigated in clinical trials for a variety of pathological conditions. In this thesis, we used different methodologies to generate bifunctional therapeutics and performed initial evaluations of their therapeutic and pharmacokinetic properties. Prompted by the postulated activity of interleukin 9 (IL9) in tumor immunity and resolution of chronic inflammation in arthritis, we have genetically engineered antibody-cytokine fusion proteins (immunocytokines) based on IL9 and the F8 antibody, which specifically recognize the EDA domain of fibronectin. An immunocytokine variant showing improved in vivo targeting efficacy was further tested for therapeutic efficacy in various preclinical disease models. In a second approach we have investigated the possibility of using small molecular ligands as targeting moieties for the pharmacodelivery of cytokines. To this aim we used the Sortase A enzyme to catalyze the covalent linkage between moieties containing specific peptidic sequences. The obtained product, termed AAZ-IL2, consisted in the fusion between acetazolamide, a CAIX ligand, and interleukin-2. Whereas AAZ-IL2 retained CAIX binding activity in vitro, it demonstrated only modest in vivo targeting efficacy. Finally, we used a chemical assembly approach to generate a fusion molecule between a therapeutic peptide and a small molecule specific to human and mouse Albumin. Due to small size, peptides have very short half-life which limits their therapeutic use. To improve the pharmacokinetics of therapeutics, Albumin represents an attractive target, due to its very high abundance in blood. Albutag, a small ligand that selectively targets specific to Albumin, has been previously used to extend the half-life of various payloads. With the aim of enhancing the pharmacokinetic properties of a therapeutically relevant peptide, we have generated a new peptide-Albutag fusion molecule, and characterized it in vitro for Albumin binding affinity and in vivo for pharmacokinetic properties. Altogether the research presented in this thesis may be of significance for the further development of bifunctional biopharmaceuticals with improved therapeutic and pharmaceutical properties.