Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules stromales mésenchymateuses natives de la moelle osseuse humaine adulte

Phenotypic and functionnal characterization of native mesenchymal stromal cells in adult human bone marrow

• Auteur / Autrice : Loïc Marc André Fievet
• Direction : Jean-Christophe Pagès, Pierre Layrolle
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiopathologie
• Date : Soutenance le 25/09/2020
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Séquençage des acides nucléiques

Os -- Croissance

Cellules de la moelle osseuse

Mots clés libres

Cellules stromales mésenchymateuses

Moelle osseuse

Niche hématopoïétique

Organoïde

Formation osseuse

Cellule souche

Analyse à l'échelle unicellulaire

Mesenchymal stromal cells

Bone marrow

Hematopoietic niche

Organoid

Bone formation

Stem cell

Single cell analysis

Résumé

Au sein de la moelle osseuse (MO), les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont logées dans un microenvironnement en 3D spécialisé, appelé ''niche''. Cette structure contribue à la régulation du comportement (e.g. auto-renouvellement, engagement dans des voies de différentiation, prolifération et survie). Cette niche est composée de plusieurs types de cellules, comme les cellules endothéliales vasculaires, périvasculaires et ostéoblastiques. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) périvasculaires jouent un rôle clé dans la formation du microenvironnement, tant par leur expression de facteurs pro-hématopoïétiques, que de leur capacité de différenciation vers le lignage ostéoblastique. Ainsi, les sous-populations de CSM composant la niche hématopoïétique sont impliquées dans la régulation de l'hématopoïèse, mais également dans la formation et la régénération du squelette. Récemment décrites chez la souris à l'échelle de la cellule unique, les sous-populations de CSM restent cependant inexplorées dans la MO humaine, il en est ainsi de leur rôle respectif dans la niche. Connaître l'identité des sous-populations cellulaires, déchiffrer leurs propriétés natives et recréer ex vivo ces niches physiologiquement fonctionnelles en 3D restent des enjeux scientifiques importants pour la compréhension de l'hématopoïèse et de l'ostéogenèse humaine. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps, utilisé des approches de séquençage d'ARN à l'échelle de la cellule unique (scRNA-seq), afin de caractériser chaque population stromale de la MO humaine et d'identifier des facteurs de niche hématopoïétique clés hautement conservés entre les espèces. Nous avons ainsi identifié plusieurs sous-populations cellulaires, exprimant différents gènes régulateurs de l'hématopoïèse, comprenant des cellules endothéliales, des cellules murales et particulièrement des CSM ayant des trajectoires ostéoblastiques et adipogéniques distinctes. De manière intéressante, nos données suggèrent une hiérarchie de différenciation à branchement simple avec la présence d'un sous-ensemble multipotent, les cellules réticulaires exprimant fortement CXCL12 (CAR) qui seraient à l'origine des autres sous-populations de CSM. Nous avons observé un enrichissement des cellules CAR exprimant le récepteur à la leptine (LEPR) dans la fraction native CD45- / CD271+ / CD200+, ainsi que leur localisation in situ en utilisant des approches histologiques sur des biopsies humaines. Dans un deuxième temps, nous avons élaboré une méthode d'isolation ex vivo pour préserver et amplifier les cellules CAR de la MO, puis étudier leur auto-organisation en culture 3D. Nous avons constaté que les sphéroïdes dérivés des cellules de type CAR ont une angiogenèse abondante, sécrètent des cytokines pro-niche et récapitulent spontanément in vitro la formation osseuse intramembranaire précoce. Grâce à des modèles bio-informatiques et des techniques d'édition du génome, nous avons mis en évidence le rôle de la protéine WDR35 et du cil primaire dans la différenciation ostéoblastique médiée par les voies de signalisation Hedgehog et Wnt. Enfin, nous avons montré que la xénotransplantation ectopique de ces sphéroïdes pouvait donner naissance à des ostéoblastes humains matures, tout en formant une niche aux CSH après humanisation hématopoïétique de souris immunodéprimées NSG. Notre étude donne, pour la première fois, une cartographie du stroma de la MO humaine avec une résolution unicellulaire et montre que les cellules CAR cultivées en 3D représentent un nouvel outil utile en recherche fondamentale avec un fort potentiel en médecine régénérative.

Within the bone marrow (BM), hematopoietic stem cells (HSC) are hosted in a specialized 3D microenvironment, called ''niche'', regulating their behavior (e.g. self-renewal, commitment to lineages, proliferation and survival). This niche is composed of several cells such as vascular endothelial, perivascular, and osteoblastic cells. Perivascular mesenchymal stromal cells (MSCs) play a key role in the formation of the microenvironment, both through expression of pro-hematopoietic factors, and their ability to differentiate towards osteoblastic lineage. Therefore, MSCs sub-populations are of crucial physiological importance in the regulation of hematopoiesis, but also for bone formation and regeneration. Recently described in mice at the single-cell level, BM MSCs subsets remain unexplored in humans, as well as their respective roles in the niche. By characterizing these sub-populations, and deciphering their native properties, it will be possible to shape ex vivo the physiological niches in 3D, addressing the major scientific challenges for understanding human hematopoiesis and osteogenesis. Here, we used single-cell RNA sequencing approaches to characterize the human BM stroma and described key hematopoietic niche factors highly conserved between species. We identified subsets of cells expressing different hematopoietic regulatory genes, spanning endothelial cells, mural cells, and especially MSCs with distinct osteoblastic and adipogenic trajectories. Of interest, our data suggest a simple branching differentiation hierarchy with the presence of a multipotent subset: the CXCL12-abundant reticular (CAR) cells at the origin of the other MSCs subpopulations. We confirmed the enrichment of the CXCL12-abundant reticular (CAR) cell subset expressing the Leptin receptor (LEPR+) in the CD45-/CD271+/CD200+ BM fraction as well as their in-situ localization using histological approaches on human biopsies. Secondly, we developed an ex vivo isolation method to preserve and amplify the BM CAR cells, and then studied their self-organization in 3D culture. We found that CAR derived organoids sustained high angiogenesis, secreted CSH niche cytokines, and spontaneously recapitulates early intramembranous bone formation in vitro. Using bioinformatics models and genome editing techniques, we highlighted the role of the WDR35 protein and the primary cilia in osteoblastic differentiation mediated by the Hedgehog and Wnt signaling pathways. Finally, we have shown that ectopic xenotransplantation of CSM-derived organoids could give rise to mature human osteoblasts while forming a niche for CSHs after hematopoietic humanization of immunocompromised NSG mice. Our study is the first map of the human BM stroma at a single-cell resolution, and CAR cells cultured in 3D represent a new tool useful in basic research as well as in regenerative medicine.