Libération vectorielle du virus de l'hépatite E dans un modèle d'hépatocytes polarisés in vitro et optimisation de la culture pour la quantification de son infectiosité

Vectorial release of hepatitis E virus on in vitro polarized hepatocytes and optimization of virus culture for infectivity quantification

• Auteur / Autrice : Nicolas Capelli
• Direction : Jacques Izopet, Sabine Chapuy-Regaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 16/01/2020
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan (Toulouse ; 2002-2020)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hépatocytes

Virus de l'hépatite E

Mots clés libres

Virus de l'hépatite E (HEV)

Hépatite E

Virus

Lipides

TCID50

Hépatocyte polarisée

Hepatitis E Virus (HEV)

Hepatitis E

Virus

Lipids

TCID50

Polarized hepatocyte

Résumé

Le virus de l'hépatite E (HEV) est l'une des causes les plus fréquentes d'hépatite aiguë dans le monde. Bien que la plupart des infections soient asymptomatiques, l'infection peut évoluer vers la chronicité chez les patients immunodéprimés et vers une hépatite fulminante chez les femmes enceintes et les patients ayant des pathologies hépatiques chroniques. Le HEV existe sous deux formes chez l'hôte, une forme nue dans les selles (nHEV) et une forme associée aux lipides (eHEV) dans le sérum. Le eHEV est aussi la forme retrouvée dans le surnageant de culture. Le eHEV utilise la voie d'exocytose pour sa biogenèse et il est libéré dans le milieu extracellulaire avec les exosomes. La cible principale du HEV, l'hépatocyte, est une cellule épithéliale polarisée avec un pôle basolatéral orienté vers le sang et un pôle apical orienté vers la bile. Des voies d'exocytose, orientées vers chacun de ces pôles, coexistent dans l'hépatocyte. Nous avons développé un modèle d'hépatocytes polarisés in vitro sur des inserts semi-perméables de collagène pour étudier le bourgeonnement et la libération du HEV à chaque pôle. Nous avons déterminé que (i) les particules virales infectieuses sont libérées préférentiellement au pôle apical (ii) les particules virales sont libérées sous forme de eHEV quel que soit le pôle cellulaire, comme en témoigne leur sensibilité à l'action détergente du NP40 (iii) le eHEV apical est légèrement plus dense que le eHEV basolatéral, ce qui suggère que les particules virales sont libérées dans des populations d'exosomes différentes (iv) dans les cellules, les protéines virales ORF2 et ORF3 s'accumulent au pôle apical des hépatocytes et colocalisent avec le marqueur apical DPP4 et la protéine impliquée dans le recyclage des endosomes tardifs, Rab27a. Le HEV étant libéré sous forme associée aux lipides aux deux pôles de l'hépatocyte infecté, ces résultats suggèrent que la forme nue retrouvée dans les selles résulterait de l'action détergente des sels biliaires. La faible proportion de particules virales libérées dans le sang assurerait la dissémination de l'infection chez l'hôte. De plus, les conditions de culture utilisées dans ce système ont permis de propager efficacement l'infection de souches cliniques du HEV jusque-là difficilement cultivables. Nous avons utilisé ces conditions de culture pour améliorer les performances de la technique de quantification de l'infectiosité basée sur une culture en dilution limite avec calcul de la TCID50 [tissue culture infectious dose 50]. Cette méthode optimisée a rendu possible la quantification de l'infectiosité du HEV issu du sang, des urines et des selles d'un même patient et a révélé la présence d'une faible proportion de eHEV infectieux dans l'urine. Cela suggère que le HEV pourrait se répliquer dans le tissu rénal. Notre technique de culture et de TCID50 est applicable dans le domaine de la sécurité sanitaire en permettant la comparaison de l'infectiosité des particules virales pour différents génotypes et matrices biologiques. Elle permet également d'évaluer les conditions d'inactivation des particules virales dans les produits dérivés du sang.

Hepatitis E virus (HEV) is one of the most common cause of acute viral hepatitis worldwide. Most HEV infections are asymptomatic, but infection can progress to chronic hepatitis in immunocompromised patient or to fulminant hepatitis, especially in pregnant women and patients with chronic liver diseases. Two forms of viral particles coexist in the host: the naked form (nHEV) found in patients stools and the lipid associated form (eHEV) in patients' blood. eHEV is also found in culture supernatant. eHEV exploit the exocytosis pathway for its biogenesis and is released with exosomes in the extracellular medium. The hepatocyte, the main target cell of HEV, is a polarized epithelial cell with a basolateral side oriented toward blood and apical sides oriented toward bile. Two exocytosis pathways, oriented toward each of these poles, coexist in the hepatocyte. We developed a model of in vitro polarized hepatocytes on semi permeable inserts of collagen to study HEV budding and release at each pole. We have determined that (i) infectious viral particles are released preferentially at the apical pole of hepatocyte (ii) these particles are release at both poles in a lipid-associated form, as shown by their sensitivity to the detergent NP40 (iii) the apical eHEV is slightly more dense than basolateral eHEV, suggesting that viral particles are released in two different exosome populations (iv) in cells, viral proteins ORF2 and ORF3 accumulate at the apical pole of hepatocytes and colocalize with the apically expressed protein DPP4 and with Rab27a, a protein involved in late endosomes recycling. HEV being released in a lipid-associated form at both poles of infected hepatocytes, the naked form found in stools would be the result of the detergent action of bile salts while the low proportion of infectious particles released to blood could spread HEV infection in its host. Moreover, culture conditions used in this system allowed us spreading infection of HEV clinical strains until now hardly cultivable. These culture conditions allowed us improving the performance of our method of HEV infectivity quantification based on an endpoint dilution with the calculation of the tissue culture infectious dose 50 (TCID50). This optimized method made it possible to quantify the infectivity of HEV from the blood, urine and stool of the same patient. We found a small proportion of infectious eHEV particles in the patient's urine, suggesting that HEV may replicate in the kidney tissue. This culture method and TCID50 technique is used in the field of health safety allowing the comparison of HEV viral particles infectivity from different genotypes or biological templates. Furthermore, it allows determining conditions for inactivation of viral particles in blood products.