Caractérisation de la fonction de l'ARN polymérase ADN-dépendante IV dans la surveillance des génomes

Caracterization of DNA-dependant RNA polymerase IV in genome surveillance

• Auteur / Autrice : Laura Ferrafiat
• Direction : Todd Blevins
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 11/09/2020
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie moléculaire des plantes (Strasbourg)
• Jury : Président / Présidente : David Gilmer
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Aline Probst, Peter Brodersen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plantes -- Génétique moléculaire

Arabidopsis thaliana

Petits ARN interférents

ARN polymérase ADN dépendante

Mots clés libres

Pol IV

SiARN de 24nt

Méthylation de l’ADN (la voie RdDM)

TE

Arabidopsis thaliana

Pol IV

24nt siRNAs

RNA-directed DNA methylation (RdDM)

TEs

Arabidopsis thaliana

Résumé

Le génome est essentiel au maintien, au développement, à la multiplication et à la reproduction de tout organisme vivant. Les ARN polymérases ADN-dépendantes (comme Pol II chez les Eucaryotes) synthétisent des ARN codants et non-codants nécessaires à ces fonctions cellulaires. L’ARN polymérase IV (Pol IV), uniquement présente chez les plantes, a évolué à partir de sous-unités dupliquées de Pol II mais se spécialise dans la surveillance du génome. Pol IV produit les précurseurs des petits ARN interférents (siARN) qui dirigent la méthylation de l’ADN aux éléments transposables (TE) limitant leurs activités délétères. Les facteurs permettant à Pol IV de cibler spécifiquement ces TE sont énigmatiques. L'objectif principal de ma thèse était de décrypter les mécanismes moléculaires de Pol IV. Pour ce faire, j’ai analysé des lignées d’Arabidopsis thaliana contenant des mutations faux-sens pol IV. Grâce à des analyses moléculaires et phylogénétiques, j’ai mis en évidence un motif unique dans la partie N-terminale de NRPD1, la plus grande sous-unité de Pol IV. Ce motif est conservé au cours de l’évolution des plantes terrestres et nécessaire à la répression des TE via les siARN de 24nt. A partir du mutant hypomorphe pol IV motif et en utilisant le gène SDC comme un rapporteur endogène, j'ai lancé un crible génétique classique qui donnera lieu à l’identification de régulateurs de l’activité de Pol IV. Enfin, le mutant pol IV motif servira à découvrir si Pol IV est recrutée dans les premières étapes de la répression des nouvelles insertions de TE. Mon analyse de longs fragments d’ADN génomique (séquençage Oxford Nanopore) a localisé des nouvelles insertions de TE dans des gènes d'A. thaliana. La présence de Pol IV et le retour de la méthylation de l’ADN sur ces copies réinsérées pourra être étudié. En conclusion, mon travail de thèse a identifié un motif protéique caractéristique de Pol IV qui est nécessaire pour la surveillance du génome. L'élucidation de la fonction moléculaire de ce motif révèlera comment Pol IV transcrit sélectivement les TE et certains gènes nécessaires à la reproduction sexuée chez les plantes. Plus généralement, Pol IV est un modèle utile pour explorer l’évolution convergente qui a façonné la transcription d'ARN non-codants chez d'autres Eucaryotes.

Genomes store information required for the maintenance, growth, development and reproduction of living organisms. DNA-dependent RNA polymerases (like Pol II in eukaryotes) synthesize both coding and non coding RNAs from the genome to mediate cellular functions. RNA polymerase IV (Pol IV) evolved from duplicated Pol II subunits in plants but specializes in genome surveillance. Pol IV transcribes genomic loci into precursors for small interfering RNAs (siRNA) that guide DNA methylation to transposable elements (TEs).This RNA-directed DNA methylation silences TEs, limiting their deleterious activity. How Pol IV finds TE targets is enigmatic. The primary aim of my thesis was to identify intrinsic features of Pol IV that allow it to target TE loci. To this end, I analyzed Arabidopsis thaliana lines harboring pol IV missense mutations. Using molecular and phylogenetic approaches, I discovered a novel motif in the N-terminus of NRPD1, the largest subunit of Pol IV. This Pol IV motif is uniquely conserved in the evolution of terrestrial plants and is required for TE silencing via 24nt siRNAs. Taking advantage of our pol IV motif hypomorphic mutant and SDC gene expression as a visible developmental marker, I launched a forward genetic screen to identify regulators of Pol IV activity. Finally, the pol IV motif mutant contributes to our strategy for testing if Pol IV is recruited during the earliest steps of genome surveillance. My analysis of long genomic DNA fragments (Oxford Nanopore sequencing) allowed us to locate TEs newly inserted in A. thaliana genes. The presence of Pol IV and de novo DNA methylation at these recently inserted, "naive" TE copies can now be studied. In conclusion, my thesis work identified a signature amino acid motif in NRPD1 that is required for Pol IV function in genome surveillance. Elucidating the precise molecular function of this motif could reveal how Pol IV selectively targets TEs and particular genes required for sexual reproduction in plants. More generally, the Pol IV non coding RNA machinery is a useful model system for exploring how convergent evolution has shaped the transcription of non-coding RNAs in other eukaryotes.