Edition de génome pour de nouvelles approches de thérapie génique des maladies à triplets

Gene editing approaches of microsatellite disorders : shortening expanded repeats

• Auteur / Autrice : Lucie Poggi
• Direction : Guy-Franck Richard, Bruno Dumas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 05/06/2020
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Unité Dynamique du génome
• Jury : Président / Présidente : Carine Giovannangeli
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Irena Draskovic
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bertrand Llorente, Nicolas Charlet-Berguerand

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nucléases

ADN -- Réparation

CRISPR-Cas9

Thérapie génique

Myotonie atrophique

Maladies neurodégénératives

Mots clés libres

Maladies à triplet

Édition de génomes

Thérapie génique

Dystrophie myotonique de type 1

TALEN

CRISPR-Cas9

Système rapporteur

Microsatellite disorders

Gene editing

Gene therapy

Myotonic dystrophy type 1

TALEN

CRISPR-Cas9

Résumé

Les maladies à triplet sont dues à des expansions de trinucléotides dans l’ADN. Aucun traitement n’existe pour les soigner. Le but de cette thèse est de mettre au point de nouvelles approches de thérapie génique pour supprimer les expansions pathologiques dans le génome humain. Dans une première partie, un système expérimental dans la levure a été construit afin d’évaluer l’efficacité de différentes nucléases associées au système CRISPR sur des microsatellites. La seconde partie est concentrée sur une maladie à triplet en particulier ; la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), qui est due à une expansion d’une répétition de triplets CTG dans la région 3’UTR du gène DMPK. Une nucléase, TALENCTG , construite pour induire une cassure double-brin dans les répétitions CTG en 3’UTR du gène DMPK, induit de manière très efficace des contractions de triplets CTG dans la levure. Des événements de contraction ont été observés lorsque cette nucléase est exprimée. Des expériences in vivo dans un modèle de souris contenant un fragment d’ADN génomique humain de patient contenant 1000 CTG ont été menées. Des particules virales AAV recombinantes portant le gène de la TALEN ont été produites. Après injection intramusculaire, les cellules musculaires expriment la nucléase, mais dû à une toxicité ou immunogénicité de la protéine, l’expression est perdue. Enfin, le système mis au point dans la levure a été transposé dans une lignée cellulaire humaine établie, les HEK293FS. Ce système pourra servir à sélectionner des nucléases actives dans les cellules humaines.

Microsatellite disorders are a specific class of human diseases that are due to the expansion of repeated sequences above pathological thresholds. These disorders have varying symptoms and pathogenic mechanisms, caused by the expanded repeat. No cure exists for any of these dramatic conditions. This thesis is investigating new gene editing approaches to remove pathological expansions in the human genome. In a first part, a yeast-based screen was constructed to identify potent CRISPR-associated nucleases that can cut these microsatellites. The second part focuses on myotonic dystrophy type 1 (DM1), which is due to and expanded CTG repeat tract located at the 3’UTR of the DMKP gene. A nuclease, TALENCTG was designed to induce a double strand break into the CTG repeats. It was previously shown to be active in yeast cells, inducing contractions of CTG repeats from a DM1 patient integrated into the yeast genome. The TALEN was tested in DM1 patient cells. The nuclease was found to trigger some contraction events in patient cells. In vivo experiments were carried out in a mouse model of myotonic dystrophy type 1 containing a human genomic fragment from a patient and 1000 CTG. Intramuscular injections of recombinant AAV encoding the TALENCTG revealed that the nuclease is toxic and/or immunogenic in muscle cells in the tested experimental conditions. Finally, the reporter assay integrated in yeast to screen nucleases was transposed in HEK293FS cell line. The integrated cassette contains a CTG expansion from a myotonic dystrophy type 1 patient flanked by two halves of GFP genes. This system would enable to find nucleases active in human cells.