Rôle de la protéine ovocytaire JUNO dans le mécanisme de blocage à la polyspermie chez les mammifères

Role of the JUNO oocyte protein in the mechanism of block to polyspermy in mammals

• Auteur / Autrice : Sophie Favier
• Direction : Christine Gourier, Ahmed Ziyyat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance le 20/03/2020
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de physique de l'ENS (Paris ; 2019-....)
• Jury : Président / Présidente : Catherine Poirot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuèle Helfer
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Fabrice Saez, Pascal Mermillod

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spermatozoïdes

Microfluidique

Membranes (biologie)

Zone pellucide

Fécondation

Mots clés libres

Fécondation

Polyspermie

JUNO

Blocage membranaire

Mammifère

IZUMO1

Fertilization

Polyspermy

JUNO

Résumé

La zone pellucide (ZP) est une barrière que le spermatozoïde doit franchir pour atteindre l’espace périvitellin (EPV) où se trouve l’ovocyte. Leur fusion conduit au zygote qui deviendra un nouvel être si aucune autre fusion engendrant une polyspermie n’a lieu. Celle-ci constitue une anomalie de la fécondation, délétère au développement. Les mécanismes mis en œuvre par le zygote pour l’empêcher ne sont que partiellement connus. Une rigidification de la ZP empêchant l’entrée de spermatozoïdes dans l’EPV se met en place. Ce blocage est effectif une heure après fusion, laissant la possibilité à d’autres spermatozoïdes d’entrer en contact avec le zygote. Un autre mécanisme de blocage doit exister pour parer leur fusion. Par une étude statistique chez la souris, j’ai prouvé l’existence et de ce second mécanisme, et son aspect physiologique. J’ai cherché à le caractériser en partant de l’hypothèse suivante : suite à une première fusion, le relargage de JUNO, protéine ovocytaire essentielle à la fécondation via sa liaison avec son ligand spermatique IZUMO1, altère les capacités adhésives et fusogènes des spermatozoïdes pénétrant l’EPV. En combinant biologie moléculaire, imagerie quantitative et micromanipulation j’ai étudié l’impact de la protéine JUNO sur la capacité de fusion du spermatozoïde par deux approches : l’une utilisant les spermatozoïdes récupérés dans l’EPV de zygotes, et l’autre des spermatozoïdes artificiellement mis en présence de JUNO. Afin de caractériser cinétiquement le relargage de JUNO et son accrochage aux spermatozoïdes pénétrant dans l’EPV, j’ai entrepris de modifier génétiquement JUNO, de façon à le rendre fluorescent sans altérer sa fonction.

Zona pellucida (ZP) is a barrier that the sperm has to pass through in order to reach the perivitelline space (EPV), which contains the oocyte. Fusion of gametes leads to the formation of a zygote, which will become a new being, unless polyspermy happens. This phenomenon constitutes a fertilization abnormality, harmful to development. Mechanisms implemented by the zygote to prevent other fusion are partially understood. The ZP rigidifies to prevent other sperm from entering the perivitelline space. However, this block is only effective after one hour of fusion, period during which other sperm may also reach the zygote. This suggests that there should be another mechanism to counter fusion of other sperm. By conducting a statistical study in mice, I have proven the existence of this second mechanism and its physiological aspect. I then sought out to characterize it with the following working hypothesis: after initial fusion, the release of JUNO, an oocyte protein essential for fertilization via its binding with its spermatic ligand IZUMO1, into the EPV alters the adhesive and fusogenic capacities of any sperm entering the EPV. By combining molecular biology, quantitative imaging, micromanipulation and laser ablation I studied the impact of the JUNO protein on the fusion capacity of the sperm by two complementary approaches, one using sperm directly recovered in the EPV of zygotes, and two using sperm artificially put in presence of JUNO. In parallel, in order to kinetically characterize the release of JUNO and its attachment to sperm, entering the EPV, I undertook to genetically modify JUNO expressed by the oocyte, so as to make it fluorescent without altering its function.