Découverte et études structure-fonction de facteurs-clés nécessaires à ls synthèse d'ADN non-standard ZTGC observé dans la famille Siphoviridae

Discovery and structure-function studies of key factors behind the non-canonical ZTGC-DNA observed in Siphoviridae family

• Auteur / Autrice : Dariusz Czernecki
• Direction : Marc Delarue
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance le 14/12/2020
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Dynamique structurale des macromolécules (2006-....)
• Jury : Président / Présidente : Eric Westhof
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mirjam Czjzek, Marie-Agnès Petit
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Zinn-Justin, Paulo Tavares

Mots clés

Mots clés contrôlés

Siphoviridés

Cristallographie

Adénine-nucléotides

ARN polymérases

ADN -- Réplication

Mots clés libres

Aminoadénine

ADN ZTGC

Z-cluster

Polymérase

Siphoviridae

Cristallographie

S-2L

Aminoadenine

ZTGC DNA

Z-cluster

Polymerase

Siphoviridae

Crystallography

S-2L

Résumé

Le but de cette thèse est de décrire le chemin métabolique permettant de remplacer l’adénine (A) par la 2-aminoadénine (Z) dans le génome de bactériophages Siphoviridae. La 2-aminoadénine et la thymine (T) forment la paire Z:T, liée par trois liaisons hydrogène. Avec la paire G:C classique, ils forment un ADN « ZTGC » qui est résistant aux enzymes de réstriction de l’hôte. En premier lieu, mes travaux se sont focalisés sur le cyanophage S-2L, décrit comme porteur de 2-aminoadénine. J’ai d’abord étudié la primase-polymérase, PrimPol, responsable de la réplication de l’ADN chez ces phages, et qui possède la capacité surprenante d’incorporer à la fois le dATP et le dZTP. J’ai ensuite caractérisé une triphosphatase dATP-spécifique, appelée DatZ, conservée chez tous les bactériophages Siphoviridae, responsable de la dégradation spécifique du dATP. J’ai également mis en évidence que PurZ, l’enzyme-clé pour la production de la diaminopurine est non seulement une ATPase mais aussi une dATPase. J’ai identifié une nucléotide pyrophosphatase, appelée MazZ, composant essentiel du chemin de biosynthèse de Z, qui convertit dGTP en dGMP, en générant ainsi un des substrats de PurZ. Structures cristallographiques de haute résolution de tous les 4 enzymes avec leurs ligands respectifs expliquent les spécificités observées dans les tests catalytiques – ou leur absence. Enfin, j’ai caractérisé une structure d’une ADN polymérase Z-spécifique de famille A, PolZ, trouvée dans le vibriophage φVC8, mais absente dans S-2L. J’ai résolu sa structure cristallographique en modes polymérase et exonuléase « couplé-ouvert » et « couplé-fermé », permettant de decrire son activité au niveau atomique.

The subject for this thesis is to dissect the enzymatic pathway allowing a non-canonical base 2-aminoadenine, or diaminopurine (Z) to replace adenine (A) in the genomes of a number of Siphoviridae bacteriophages. 2-aminoadenine and thymine (T) form the Z:T pair bound by fully saturated triple hydrogen bond. Together with the standard G:C pair they form ZTGC-DNA which is resistant to host’s restriction enzymes. I first focus on cyanophage S-2L, the originally-described bearer of 2-aminoadenine. I identify a DNA primase-polymerase, PrimPol, responsible for its replication, with surprisingly similar activity towards dATP and dZTP. This prompted the characterization of a dATP-specific triphosphatase, DatZ. Its activity and conservation between the phages of interest explains the mechanism behind adenine removal. Secondly, I find that PurZ of phage S-2L’s, a key enzyme in diaminopurine production, is not only an ATPase but also a dATPase. I identify a nucleotide pyrophosphatase, MazZ, as an essential component of the conserved Z biosynthetic pathway, that converts dGTP into dGMP, thus generating one of the substrates of PurZ. High resolution crystallographic structures of all 4 enzymes with their respective ligands explain the specificities observed in catalytic tests - or lack thereof. Finally, I characterized the structure of a Z-specific family A DNA polymerase, PolZ, found in a related vibriophage φVC8 but absent in S-2L. Its crystallographic structure in polymerase-exonuclease “coupled-open” and “coupled-close” states offers an explanation for the observed specificity.