Nouveaux outils miniaturisés pour l’analyse de biomolécules dans des fluides biologiques

New miniaturized tools for the analysis of biomolecules in biological fluids

• Auteur / Autrice : Stan Perchepied
• Direction : Valérie Pichon-Comparot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Soutenance le 08/12/2020
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie, Biologie, Innovation (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Franck Launay
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benjamin Carbonnier, Nathalie Delaunay-Bertoncini
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Claire Demesmay-Guilhin, Marianne Fillet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glycosylation

Chromatographie en phase liquide

Analyse

Protéines

Enzymes immobilisées

Mots clés libres

Enzyme immobilisée

Analyse de protéine

Monolithe

Nanochromatographie liquide

Miniaturisation

Glycosylation

Immobilized enzyme reactor

Protein analysis

Monolith

Nano Liquid Chromatography

Miniaturization

Glycosylation

Résumé

L’analyse de protéines est principalement réalisée selon l’approche bottom-up qui consiste en une digestion enzymatique et l’analyse des peptides obtenus en chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. L’étape de digestion, réalisée en solution, est une procédure longue. L’utilisation de réacteurs à base d’enzymes immobilisées (IMER) ainsi que leur intégration en ligne avec la LC-MS/MS améliore la fiabilité et la sensibilité de la méthode globale. Le premier objectif de cette thèse a été d’évaluer le potentiel des IMER pour la caractérisation de la glycosylation. La complémentarité d’IMER de pepsine et de trypsine, développés en format classique par greffage sur support de Sepharose, a permis d’identifier les N-glycanes sur les 4 sites de glycosylation d’une hormone de grossesse contenue dans 2 médicaments. Le second objectif était la miniaturisation de ces outils. Des monolithes obtenus par voie sol-gel ou par polymérisation radicalaires ont été synthétisés in situ dans des capillaires de 100 µm de diamètre interne. La meilleure répétabilité de synthèse de la voie radicalaire a conduit à la sélection des supports obtenus par cette voie pour leur greffage par de la trypsine ou de la pepsine. Un montage miniaturisé pour l’analyse de digestats a été aussi réalisé. Cela permettra l’inclusion postérieure de l’IMER dans le dispositif analytique.

Protein analysis is mainly carried out using the ''bottom-up'' approach which is based on enzymatic digestion of proteins and analysis of resulting peptides by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Usually, enzymatic digestion is carried out in solution. However, this procedure is long. The use of immobilised enzyme reactors (IMER) and their hyphenation with LC-MS/MS increases the reliability and sensitivity of the overall method. The study conducted during this thesis had two distinct objectives. The first was to evaluate the potential of IMERs for glycosylation characterisation. The complementarity of IMERs of pepsin and trypsin, developed in classical format by grafting the proteases on a Sepharose support, allowed to identify the N-glycans on the 4 glycosylation sites a pregnancy hormone contained in 2 drugs. The second objective was the miniaturization of these tools. To do this, monoliths obtained by sol-gel approach in the presence of organosilanes or by radical polymerization of organic monomers were synthesized in situ in capillaries of 100 µm internal diameter. The better repeatability of synthesis of organic supports led to their selection for functionalization by trypsin or pepsin. In parallel, a miniaturised set-up for the analysis of digests was carried out. This will allow the subsequent inclusion of IMER in the overall analytical device.