Étude de la diversité moléculaire définissant l'hétérogénéité des cellules souches musculaires

Investigation of the molecular diversity defining muscle stem cell heterogeneity

• Auteur / Autrice : Maria Benavente Diaz
• Direction : Shahragim Tajbakhsh
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Cellules souches et Médecine régénérative
• Date : Soutenance le 03/11/2020
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Cellules Souches et Développement
• Jury : Président / Présidente : Thierry Jaffredo
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Cadot, Lucie Peduto
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Athanassia Sotiropoulos, Graziella Messina

Mots clés

Mots clés contrôlés

Myogénèse

Protéomique

Cellules souches

Matrice extracellulaire

Muscles -- Régénération (biologie)

Mots clés libres

Cellules souches musculaires

Matrice extracellulaire

Muscles extraoculaires

Séquençage de cellule unique

Protéomique

Différenciation

Hétérogénéité

Muscle stem cells

Extracellular matrix

Extraocular muscles

ScRNA-seq

Proteomics

Differentiation

Heterogeneity

Résumé

Le muscle squelettique adulte a une capacité de régénération remarquable, pouvant guérir après des traumatismes répétés. Cette propriété dépend de la présence de cellules souches musculaires (SCMu), qui sont pour la plupart quiescentes dans des conditions homéostatiques mais qui s'activent après une blessure, réintègrent le cycle cellulaire et prolifèrent pour donner naissance à des myoblastes qui fusionneront pour restaurer les fibres endommagées. De nombreuses études ont étudié les états transitoires que les SCMu empruntent de l'entrée du cycle cellulaire à la différenciation. Malgré le fait que plusieurs souris rapportrices génétiquement modifiées aient été générées pour examiner ces événements, l'initiation de la différenciation, qui est généralement définie par l'expression du facteur de régulation myogénique Myogenin, est difficilement appréciable à cause du manque de souris rapportrice fiable. Par conséquent, nous avons développé une nouvelle lignée rapportrice où la différenciation des cellules myogéniques exprimant le facteur de transcription Myogenin peut être marquée par l'expression d'une protéine fluorescente tdTomato. Cette nouvelle lignée de souris knock-in nous a permis d'analyser la cinétique de l'expression de Myogenin lors de la différenciation cellulaire in vitro et d'effectuer des expériences préliminaires in vivo par imagerie intravitale. De plus, bien que toutes les SCMu de souris soient caractérisées par l'expression du facteur de transcription Pax7, plusieurs études ont décrit des différences de prolifération, de capacité de transplantation et de sensibilité à la maladie entre les SCMu des muscles crâniens et des membres. Pour étudier les réseaux de régulation des gènes qui régissent cette hétérogénéité fonctionnelle, nous avons combiné des analyses transcriptomiques sur cellules uniques avec des approches de biologie cellulaire utilisant des lignées de souris rapportrices pour identifier les régulateurs clés qui confèrent des propriétés distinctes aux SCMu à haute-performance (extraoculaires) et à faible-performance (tibialis antérieur) en quiescence et lors de l'activation. Nous avons identifié un retard dans la différenciation des SCMu extraoculaires en culture, accompagné par l'expression de facteurs de remodelage de la matrice extracellulaire et de récepteurs membranaires distincts et nous avons validé l'expression de certains de ces candidats au niveau protéique. Des analyses informatiques avancées ont mis en évidence la dynamique sous-jacente au maintien d'une population de progéniteurs dans les SCMu extraoculaires, contrôlée par un réseau singulier de facteurs de transcription formant un module de molécules co-régulées. En conclusion, ces études apportent de nouvelles informations sur les mécanismes qui octroient des propriétés différentes des cellules souches musculaires venant d'emplacements anatomiques distincts.

Adult skeletal muscle has a remarkable regenerative capacity, being able to recover after repeated trauma. This property depends on the presence of muscle stem cells (MuSCs), which are mostly quiescent in homeostatic conditions, re-enter the cell cycle after injury and proliferate to give rise to committed myoblasts that will eventually fuse to restore the damaged fibres. Numerous studies have investigated the cell state transitions that MuSCs undergo from cell cycle entry to differentiation. Although several genetically modified reporter mice have been generated to study these events, detailed studies on the initiation of differentiation, which is generally defined by expression of the myogenic regulatory factor Myogenin, have been hampered by the lack of a reliable reporter mouse. Therefore, we developed a fluorescent reporter line where differentiating myogenic cells expressing Myogenin are marked by the expression of a tdTomato fluorescent protein. This novel knock-in mouse line allowed us to monitor the kinetics of Myogenin expression during cell differentiation in vitro, and perform preliminary experiments on the behaviour of myogenic cells in vivo by intravital imaging. Although all mouse MuSCs are characterised by the expression of the transcription factor Pax7 and they share several properties, some studies have reported differences in proliferation, engraftment ability, and sensitivity to disease of MuSCs from cranial and limb muscles. To investigate the gene regulatory networks that govern this functional heterogeneity, we have integrated single-cell transcriptomic analyses with cell biology approaches using mouse reporter lines to identify key regulators that confer distinct properties to high performing (extraocular muscles) and lower performing (limb, Tibialis anterior muscle) MuSCs in quiescence and activated states. We identified a delayed lineage progression of extraocular MuSCs in culture that was accompanied with the expression of distinct extracellular matrix remodelling factors and membrane receptors, and we validated the expression of some of these candidates at the protein level. Advanced computational analyses highlighted the dynamics underlying the maintenance of a stem-like progenitor population in extraocular MuSCs, controlled by a singular network of transcription factors acting as a co-regulating module. Taken together, these studies provide novel insights into the mechanisms underlying the differential properties of muscle stem cells in distinct anatomical locations.