Specific labeling strategies for new developments in liquid state protein NMR

par Rachel Lenoir-Capello

Thèse de doctorat en Chimie physique et Chimie analytique

Sous la direction de Emeric Miclet.

Le président du jury était Jérôme Boisbouvier.

Le jury était composé de Teresa Carlomagno, Juliette Sirieix-Plénet.

Les rapporteurs étaient Christina Sizun, Benoît Odaert.

  • Titre traduit

    Stratégies de marquages spécifiques pour de nouveaux développements en RMN liquide des protéines


  • Résumé

    La résonance magnétique nucléaire (RMN) fournit des informations structurelles et dynamiques précieuses à l'échelle atomique, cependant, la faible sensibilité et résolution des signaux empêchent l’étude d'objets moléculaires plus importants. Nous présentons 3 stratégies de marquage isotopique pour différentes expériences RMN des protéines en solution et démontrons leur potentiel pour l'étude structurale des biomolécules. Parmi les stratégies envisagées, 2 utilisent l'expression in vitro pour obtenir des protéines marquées sélectivement sur un groupe chimique et/ou acide aminé dans un environnement perdeutéré. Avec l’utilisation de séquences d'impulsions TROSY, ces échantillons ont permis des gains spectraux importants lorsque ils étaient spécifiquement marqués sur des groupes amide ou sur le méthylène des glycines tout en maintenant un taux de deutération élevé sur les autres fonctions chimiques des protéines. La troisième stratégie de marquage protéique utilise des protocoles in vivo pour des applications RMN innovantes: l'hyperpolarisation de noyaux en solution qui augmente leur sensibilité de plusieurs ordres de grandeur. La durée de vie de cette hyperpolarisation est régie par le temps de relaxation longitudinale des noyaux, qui est réduit pour les protéines à température ambiante. En isolant les noyaux d'intérêt dans un environnement perdeutéré, les interactions dipolaires créées par les protons voisins sont éliminées et les noyaux hyperpolarisés relaxent beaucoup plus lentement. L'hyperpolarisation d'un petit domaine protéique a été entreprise avec succès mais les conditions de dissolution doivent encore être améliorées pour conserver une phase aqueuse homogène.


  • Résumé

    Nuclear Magnetic Resonance (NMR) provides valuable structural and dynamic information at the atomic scale, however, the low sensitivity and resolution of signals rapidly preclude investigations of larger molecular objects. We present three isotopic labeling strategies for different protein-solution NMR experiments and demonstrate their potential for the structural study of biomolecules in solution. Among the strategies considered, two are based on the use of in vitro protein expression to obtain selectively labeled proteins of a certain chemical group and/or amino acid in a perdeuterated environment. Perdeuteration is essential for the optimal use of Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy pulse sequences. They allowed significant spectral gains when samples were specifically labeled on amide groups or on the methylene of glycines while maintaining a very high rate of deuteration on the other chemical functions of the proteins. The third protein labeling strategy employed is based on in vivo protocols but used in innovative NMR applications: a technique of hyperpolarization of nuclei in solution which increases their sensitivity by several orders of magnitude. The lifetime of this hyperpolarization is governed by the longitudinal relaxation time of nuclei, which are reduced for proteins at room temperature. By isolating the nuclei of interest in a perdeuterated environment, dipolar interactions created by neighboring protons were eliminated and hyperpolarized nuclei relaxed much more slowly. Hyperpolarization of a small protein domain was successfully undertaken at 1K but the dissolution conditions need to be improved in order to preserve a homogeneous aqueous phase.

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