Mesure et analyse des effets protecteurs des hémoglobines anti-polymérisantes dans la drépanocytose : application aux stratégies de thérapie génique

Measurement and analysis of the protective effects of anti-sickling hemoglobins in sickle cell disease : application to gene therapy strategies

• Auteur / Autrice : Nicolas Hebert
• Direction : Pablo Bartolucci
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 16/11/2020
• Etablissement(s) : Paris Est
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Créteil ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Mondor de Recherche Biomédicale (Créteil) - Institut Mondor de Recherche Biomédicale / IMRB
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Eq 02 - Transfusion et maladies du globule rouge
• Jury : Président / Présidente : France Pirenne
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pablo Bartolucci, Anne Galy, Guillaume Lettre, Marina Cavazzana-Calvo, Carlo Brugnara, Philippe Connes
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Galy, Guillaume Lettre

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thérapie génique

Drépanocytose

Mots clés libres

Chimérisme érythrocytaire

Hémoglobine

Drépanocytose

Thérapie génique

Erythrocyte chimerism

Hemoglobin

Sickle cell disease

Gene therapy

Résumé

La drépanocytose est une maladie héréditaire dans laquelle les globules rouges (GR) ont un variant de l'hémoglobine (Hb), appelée HbS. Elle est causée par la substitution d'un seul acide aminé de la sous-unité béta-globine : une valine au lieu d'un acide glutamique en sixième position. Cette mutation confère à l’HbS la capacité de polymériser sous l'effet de la désoxygénation, entraînant la formation de longues fibres. Les GR normaux sont élastiques, circulent librement et vivent généralement entre 90 et 120 jours. Les GR drépanocytaires sont rigides, déshydratés, très sensibles à l'hémolyse, ont une durée de vie de 10 à 20 jours et ont tendance à rester coincés en raison de la polymérisation de l'HbS, ce qui entraîne un blocage de la circulation sanguine. Les progrès de la biologie cellulaire et moléculaire ont conduit au développement de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) allogéniques, la seule option curative disponible pour les patients. Cependant, la transplantation de CSH est confrontée à des problèmes tels que le manque relatif de donneurs compatibles et les risques de maladie du greffon contre l'hôte ou de rejet du greffon. C'est pourquoi la thérapie génique est une alternative prometteuse. Elle consiste en une modification génétique des CSH autologues pour exprimer de l'Hb anti-polymérisante comme l'Hb foetale (HbF) ou des Hb génétiquement modifiées pour inhiber la polymérisation de l'HbS. Pour cela, l'Hb anti-polymérisante doit être exprimée en quantité suffisante par GR. Il est donc indispensable de disposer d'outils capables d'évaluer à la fois la teneur en Hb des GR et leurs propriétés fonctionnelles. Nous décrivons ici le développement d'une nouvelle méthode permettant la quantification précise de l'HbF dans des GR individualisés. Nous montrons que ce test est suffisamment précis pour mesurer des seuils d'HbF avec une pertinence clinique. Comme preuve de concept, nous avons déterminé des seuils de protection de l'HbF chez des patients atteints de drépanocytose et traités avec de l'hydroxyurée, un inducteur d'HbF. Nous montrons également que cette méthode est intéressante pour évaluer l'efficacité de la thérapie génique. Enfin, nous rapportons que l'analyse des propriétés des GR peut démontrer la correction fonctionnelle induite par l'expression d'Hb anti-polymérisante. Dans l'ensemble, nous démontrons le potentiel et la pertinence de ces analyses pour mieux caractériser l'efficacité des stratégies de thérapie génique visant à guérir la drépanocytose.

Sickle cell disease (SCD) is an inherited disorders in which red blood cells (RBCs) have a variant of the hemoglobin (Hb), named HbS. It is caused by the substitution of a single amino acid in the beta-globin subunit: a valine instead of a glutamate in the sixth position. This mutation results in the capability of HbS to polymerize under deoxygenation, leading to the formation of long fibers. Normal RBCs are elastic, flow freely through circulation and typically live between 90-120 days. Sickle RBCs are rigid, dehydrated, highly sensitive to hemolysis, have a 10-20 days lifespan, and tend to get stuck because of HbS polymerization, resulting in blood flow blockage. Advances in cellular and molecular biology have led to the development of allogenic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation, the only available curative option for patients. However, HSC transplantation faces issues such as relative lack of sibling donors, risks of graft versus host disease or graft rejection. Therefore, gene therapy is a promising alternative. It consists in genetical modification of autologous HSC to express anti-sickling Hb such as fetal Hb (HbF) or HbF-based engineered Hb inhibiting HbS polymerization. To be successful, anti-sickling Hb must be expressed in enough quantity per RBC. Therefore, disposing of tools able to assess both Hb content in RBCs and functional properties of RBCs are mandatory. Herein we describe the development of a new method allowing precise HbF quantification in individual RBCs. We show that this assay is precise enough to measure thresholds of HbF with clinical relevance. As a proof of concept, we determined protective thresholds of HbF in SCD patients treated with hydroxyurea, a well-known HbF inducer. We also showed that this method is of interest in assessing gene therapy efficacy. Lastly, we report that analyzing RBCs properties can demonstrate functional correction induced by anti-sickling Hb expression. Altogether, we demonstrate the potential and the relevance of these analyzes to better characterize gene therapy strategies efficacy aiming to cure SCD.