Étude des anomalies de XPO1 dans les lymphomes B

Study of XPO1 abnormalities in B cell lymphomas

• Auteur / Autrice : Hadjer Miloudi
• Direction : Brigitte Sola, Fabrice Jardin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 25/06/2020
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université de Caen Normandie (1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer and Brain Genomics (Rouen ; 2022-....)
• Jury : Président / Présidente : Christel Guillouf
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Brigitte Sola, Fabrice Jardin, Florence Nguyen Khac, Gaëtan Jego
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Florence Nguyen Khac, Gaëtan Jego

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cancérogenèse

Mutation (biologie)

CRISPR-Cas9

Exportine 1

Hodgkin, Maladie de

Lymphome médiastinal primitif à grandes cellules B

Mots clés libres

XPO1, mutation E571K

CRISPR-Cas9

Primary mediastinal B-cell lymphoma

Hodgkin lymphoma

Selinexor

Résumé

L'exportine-1 (ou XPO1) joue un rôle clé dans le transport de nombreux ARN et près de 200 protéines cargos. La mutation « hot-spot » XPO1-E571K est présente chez près de 25% des patients atteints par le lymphome primitif du médiastin (PMBL) et la forme classique du lymphome de hodgkin (cHL), et à plus faible fréquence dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC) (3%). Des mutations touchant la voie JAK2/STAT6 sont aussi retrouvées dans le PMBL et le cHL. C’est pourquoi nous avons étudié l’implication de XPO1 dans la voie JAK2/STAT6. Nous avons montré que STAT6 est une protéine cargo de XPO1 par les technique immunofluorescence et PLA (Proximity Ligation Assay). Nous avons montré que le traitement au selinexor induit une accumulation nucléaire de STAT6 sauvage et mutée et que STAT6 peut interagir avec les formes mutée et sauvage de XPO1.Afin de rechercher l’impact fonctionnel de la mutation E571K de XPO1 nous avons comparé plusieurs paramètres physiologiques entre les trois lignées de PMBL. Aucune différence n’a été observée. En effet, la présence de l’amplification de l’allèle sauvage dans la lignée présentant la mutation E571K (MedB1) pourrait masquer les éventuels effets de la mutation. De plus, dans la cohorte de patients que nous avons étudiée la mutation n’est jamais retrouvée à l’état homozygote ou hémizygote indiquant l’importance du dosage génique. Nos expériences de CRISPR-Cas9 sur la lignée U2940 dont le gène XPO1 est sauvage ont confirmé notre hypothèse. De manière intéressante, la présence de la mutation E571K modifie l’affinité de XPO1 pour le selinexor. En effet, le KO de l’allèle muté dans la lignée de cHL UH-01 rend les cellules moins sensibles au selinexor. Nous avons conclu que la balance entre l’allèle sauvage et l’allèle muté est un élément clé pour définir les propriétés oncogéniques de XPO1. Dans une étude préliminaire, une étude protéomique dans les lignées PMBL indique que XPO1-E571K est liée à l’importine-β1 ce qui pourrait modifier la localisation subcellulaire de XPO1.Nous avons montré que la localisation cytoplasmique de cycline D1 contrôle le mécanisme d’invasion et de migration dans cellules de lymphome à cellules du manteau (MCL). Cycline D1 étant une protéine cargo de XPO1 nous avons recherché d’éventuelles anomalies de XPO1 dans les lignées de MCL. Aucune anomalie d’expression de localisation ou de fonction de n’a été observée. Il pourrait être intéressant de déterminer la localisation subcellulaire de cycline D1 au moment du diagnostic afin de proposer une meilleure prise en charge pour les patients. De plus, bien que le selinexor soit toujours en essai clinique, son utilisation pour le traitement du MCL pourrait être envisagée dans les cas les plus agressif où cycline D1 est cytoplasmique.

Exportin-1 (or XPO1) plays a key role in the nuclear export of several RNAs and more than 200 proteins. The XPO1-E571K ''hot-spot'' mutation is present in nearly 25% of patients with primary mediastinal B-cell lymphoma (PMBL), and the classical form of Hodgkin lymphoma (cHL) but at a lower frequency (3%) in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Mutations affecting the JAK2/STAT6 pathway are common in PMBL and cHL. We first studied the role of XPO1 in the nuclear export of STAT6 in PMBL cell lines. Using immunofluorescence and proximity ligation assay (PLA) techniques, we showed that STAT6 is a cargo of XPO1. We also showed that a selinexor treatment induced a nuclear accumulation of wild-type and mutant STAT6 whatever the XPO1 status.In order to investigate the functional impact of the XPO1-E571K mutation, we compared several physiological parameters between the three PMBL cell lines bearing or not the mutation. No differences were observed despite the expression of the XPO1E571K allele. However, in the cell line harboring the XPO1 mutation (MedB1), the wild-type (wt) allele was amplified possibly masking the effects of the mutation. In addition, in the cohort of patients we studied, the mutation was never found in the homozygous or hemizygous state indicating the importance of the gene dosage. CRISPR-Cas9 experiments allowing the introduction of the mutation in the U2940 wt cell line confirmed our hypothesis. Interestingly, the presence of the E571K mutation changed the affinity of XPO1 for selinexor. Indeed, the knockout of the mutated allele in the cHL UH-01 line decreased its sensitivity to selinexor. We concluded that the balance between the wt and the mutated alleles is a key element in defining the oncogenic properties of XPO1. In a preliminary study, we conducted a proteomic analysis to identify XPO1E571K partners in the PMBL lines. Our results showed that XPO1E571K interacts with the importin-β1 which could modify the subcellular localization of XPO1.Mantle cell lymphoma (MCL) cells are characterized by the overexpression of cyclin D1. Cyclin D1 being an XPO1 cargo protein, we looked for possible XPO1 abnormalities in several MCL cell lines. No abnormalities in the expression, localization neither function of XPO1 were observed. But, we showed that the cytoplasmic portion of cyclin D1 controlled the invasion and migration of MCL cells. It might be interesting to determine the subcellular localization of cyclin D1 at the time of diagnosis in order to offer a better treatment management for MCL patients. In addition, although selinexor is still in clinical trials, its use for the treatment of MCL could be considered in the most aggressive cases where cyclin D1 is cytoplasmic.