Etude des principes d’assemblage et de maturation des kinases de la famille des PIKKs chez Schizosaccharomyces pombe

par Damien Toullec

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Dominique Helmlinger.

Soutenue le 30-10-2020

à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé , en partenariat avec Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire (Montpellier) (laboratoire) .

Le président du jury était Édouard Bertrand.

Le jury était composé de Dominique Helmlinger, Édouard Bertrand, Martine Collart, Laszlo Tora, Micheline Fromont-Racine.

Les rapporteurs étaient Martine Collart, Laszlo Tora.


  • Résumé

    Une majorité de protéine fonctionne au sein de complexes multimériques plutôt qu’individuellement. Ceux-ci régulent de nombreuses fonctions, comme le métabolisme, l’expression des gènes ou la réparation des dommages à l’ADN. Ces processus ont en commun d’avoir au moins un membre de la famille des kinases dites PIKKs impliqué dans leur régulation. De nombreuses études se sont intéressées à la structure, la composition, l’activité et la régulation des complexes de PIKKs. Cependant, peu de travaux ont étudié la dynamique et le mécanisme d’assemblage des PIKKs au sein de leurs complexes, ou les facteurs qui contrôlent ce processus. Un défaut dans la coordination de l'expression, de la maturation ou de l'assemblage des sous-unités de ces complexes peut affecter leurs fonctions et causer un stress protéotoxique. Mes travaux de thèse ont cherché à identifier les principes régissant l’assemblage de complexes multimériques, en utilisant principalement SAGA comme paradigme d’étude. Dans un premier temps, j’ai développé un nouvel un outil génétique, appelé Recombination Induced Tag Exchange (RITE), chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Cet outil permet l'échange contrôlé d’épitopes dans une protéine d'intérêt et m’a permis de purifier, pour la première fois, une forme néosynthétisée du complexe SAGA. Malheureusement, cet outil ne permet pas d’avoir une sensibilité et une résolution temporelle suffisantes pour identifier les intermédiaires et les facteurs d’assemblage de SAGA. Cependant, j’ai modifié le système RITE afin de suivre spécifiquement le destin de la forme néosynthétisée d’une sous unité de SAGA, Tra1. Ainsi, j’ai pu démontrer l’existence d’étapes ordonnées dans l’assemblage de SAGA de novo, par lesquelles Spt20 recrute Tra1, qui elle-même précède l’incorporation du module DUB. En parallèle, mon travail a aussi permis de montrer que Hsp90 et sa cochaperone, TTT, sont nécessaires à l’incorporation de novo de Tra1 dans le complexe SAGA. Enfin, nous avons identifié le mécanisme par lequel TTT stimule la maturation des PIKKs. TTT s’associe de manière cotraductionnelle avec les PIKKs, en reconnaissant leur domaine le plus conservé. L’ensemble des données accumulées au cours de mes travaux et au laboratoire suggèrent qu’il existe une ségrégation spatiale et temporelle entre l’acquisition de la forme native de la PIKK et de son assemblage au sein de son complexe. Le rôle de TTT serait donc de prendre en charge la PIKK en cours de synthèse afin de protéger le polypeptide néosynthétisé contre la dégradation, l’agrégation ou les interactions précoces, le temps que la synthèse soit terminée. Mon travail a contribué à apporter de nouveaux éclaircissements sur les principes qui régissent l’assemblage de complexes multifonctionnels, ce qui est important pour la compréhension de leur organisation structurale et leur régulation.

  • Titre traduit

    Principles of the maturation and assembly of PIKK kinases in Schizosaccharomyces pombe


  • Résumé

    Many proteins function as part of multimeric complexes rather than individually. These complexes regulate many cellular functions such as metabolism, gene expression or DNA damage repair. All these pathways are regulated by at least one member of the PIKK family of kinases. So far, although many efforts have been made to characterize the biochemical composition and stoichiometry of PIKK-containing complexes, our knowledge of the dynamics and regulation of their assembly remains scarce. Cells need to coordinate the expression, maturation, and assembly of individual subunits because defects in these processes result in the accumulation of misfolded or unassembled subunits, which compromises their functions and can cause proteotoxic stress. My thesis project aimed at identifying the principles underlying the assembly of large multifunctional complexes, using the SAGA co-activators as a paradigm. First, I implemented a genetic tool, called Recombination Induced Tag Exchange (RITE), in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. This tool allows a controlled epitope switch within a protein of interest and I used it to purify newly synthetized SAGA complexes. Unfortunately, this tool does not have sensitive and resolutive enough to identify assembly intermediates or specific assembly factors. However, I derived the RITE system to follow the fate of newly synthetized Tra1, a SAGA subunit and revealed that SAGA assembly follows an ordered pathway. Indeed, the Spt20 subunit is necessary and sufficient to recruit Tra1, which itself causes the de novo incorporation of the DUB module. Next, we provided new insights into the mechanism by which the Hsp90 cochaperone, TTT, stimulates PIKK maturation and assembly. First, I showed that TTT and Hsp90 are required for the de novo incorporation of Tra1 into SAGA. Second, I demonstrated that TTT binds to its substrates cotranslationally, by recognizing the most conserved domain of PIKKs. Together with other results from the laboratory, our work suggests that there is a spatial and temporal segregation between the acquisition of the native form of PIKKs and their assembly. The role of TTT would therefore be to chaperone PIKK during synthesis in order to protect nascent polypeptides from degradation, aggregation or premature interactions, while synthesis completes. Overall, my work provides new insights into the molecular basis of multifunctional complex assembly, which is important to understand their structural organization and their regulation.


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